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Aug 07, 2023

Un transportador candidato que permite a los dinoflagelados simbióticos alimentar a sus anfitriones coralinos

ISME Comunicaciones volumen 3,

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 7 (2023) Citar este artículo

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La asociación simbiótica entre los corales y las algas dinoflageladas es crucial para los arrecifes de coral. Los corales proporcionan refugio, dióxido de carbono y nitrógeno a sus simbiontes de algas. A cambio, las algas simbióticas suministran a sus anfitriones animales carbono fijo en forma de glucosa. Pero se desconoce cómo se transfiere la glucosa del simbionte de algas al huésped animal. Pensamos que un transportador residente en la membrana celular del dinoflagelado facilitaría la transferencia de glucosa hacia el exterior al tejido animal huésped circundante. Identificamos un transportador candidato en el dinoflagelado simbionte cnidario Breviolum minutum que pertenece a la familia ubicua de uniportadores de azúcar facilitadores conocidos como SWEET (los azúcares eventualmente serán transportadores exportados). Los análisis de expresión génica anteriores habían demostrado que BmSWEET1 aumenta cuando las algas viven simbióticamente en un huésped cnidario en comparación con el estado de vida libre [1, 2]. Utilizamos microscopía de inmunofluorescencia para localizar BmSWEET1 en la membrana celular de dinoflagelados. Los ensayos de preferencia de sustrato en un sistema de transporte sustituto de levadura mostraron que BmSWEET1 transporta glucosa. La microscopía cuantitativa mostró que las células simbióticas de B. minutum tienen significativamente más proteína BmSWEET1 que las células de vida libre de la misma cepa, lo que es consistente con la exportación durante la simbiosis pero no durante la fase planctónica de vida libre. Por lo tanto, BmSWEET1 está en el lugar correcto, en el momento correcto y tiene el sustrato correcto para ser el transportador con el que las algas dinoflageladas simbióticas alimentan a sus anfitriones animales para alimentar los arrecifes de coral.

La simbiosis es una poderosa estrategia evolutiva que combina conjuntos de habilidades de especies separadas para enfrentar los desafíos de selección ambiental como un consorcio. En el caso de los arrecifes de coral, la asociación permite un crecimiento abundante en aguas pobres en nutrientes que, de lo contrario, soportarían muy poca biomasa [3]. Las simbiosis de los arrecifes de coral son notablemente exitosas. Aunque los arrecifes ocupan solo el 0,1 % del entorno marino, sustentan más del 33 % de la diversidad marina [4].

Las algas simbióticas de los corales utilizan CO2 y energía luminosa para fabricar azúcares mediante la fotosíntesis. El azúcar alimenta al coral, y esta 'transferencia monetaria' simbiótica [5] sustenta la capacidad de la mayoría de los corales para depositar carbonato de calcio y así construir un arrecife [3]. A su vez, el anfitrión coralino proporciona a sus algas simbiontes refugio, CO2 y nitrógeno precioso. La transferencia de carbono fijado fotosintéticamente del simbionte al huésped fue demostrada hace más de 60 años por Muscatine y Hand [6], y los simbiontes proporcionan hasta el 90 % de la energía utilizada por un coral [3]. Los primeros trabajos, que utilizaron simbiontes extraídos del huésped, indicaron que el glicerol era el principal producto de exportación [7]. Sin embargo, estudios recientes que utilizan asociaciones intactas muestran que la glucosa es la principal exportación y sugieren que la liberación de glicerol por parte de los simbiontes es un artefacto inducido al aislarlos de su huésped [8,9,10], o tal vez transportado a la vacuola del simbiosoma como un osmolito [ 11]. Por lo tanto, sabemos qué forma de fotosintato se transfiere y cuánta transferencia ocurre, pero esencialmente no sabemos nada sobre cómo ocurre la transferencia.

El fotosintato transferido debe atravesar al menos dos membranas: la membrana celular de las algas; y el llamado simbiosoma, una membrana similar a una vacuola creada durante la absorción fagocitaria de un simbionte por un huésped [12]. Dado que la glucosa es impermeable a la membrana, probablemente haya transportadores en una o ambas membranas para mover la glucosa hacia el exterior. Nuestra hipótesis es que al menos un transportador estará en la membrana de la célula simbionte y será predominantemente activo en hospite. Para identificar los transportadores, comparamos previamente la expresión génica en células simbióticas y de vida libre de Breviolum minutum [1], un simbionte dinoflagelado de corales y anémonas [13]. Varios transportadores mostraron una mayor expresión en hospite [1], y uno, que llamamos BmSWEET1, se caracteriza más aquí.

Las anémonas de mar Exaiptasia diaphana del genotipo AIMS3 [13] se mantuvieron en una sala de temperatura constante sin cita previa bajo la temperatura constante de 26 °C, ciclo de fotoperíodo de luz:oscuridad de 12:12 h y fotones de 15 μmol m-2 s-1 ( las anémonas GBR son sensibles a la luz y prefieren condiciones de poca luz [13]), junto con un suministro constante de aire. Las anémonas se mantuvieron en tres recipientes de plástico replicados de 2,4 L con agua de mar (Sal del Mar Rojo, salinidad de 34 ppt), en las mismas condiciones. Las anémonas se alimentaron ad libitum dos veces por semana con Artemia sp. los nauplios (eclosionados durante la noche bajo un suministro de aire constante) y las algas filamentosas se eliminaron antes de los cambios completos de agua semanales.

Se aislaron células de B. minutum y se cultivaron a partir de una única anémona de E. diaphana con genotipo [14]. Se generaron tres subcultivos replicados en matraces de cultivo celular (tapa ventilada con membrana de 0,2 μm) con agua de mar filtrada (FSW) de 0,2 μm complementada con 1 x medio IMK de Diago (Novachem). Los cultivos se mantuvieron en una cámara de crecimiento (740FHC LED, HiPoint) a una temperatura constante de 26 °C, ciclo de fotoperíodo luz:oscuridad de 12:12 h y fotones de 60 μmol m-2 s-1. Los cultivos se controlaron de forma rutinaria mediante microscopía óptica para evaluar su salud (las células están intactas, son vitales y hay células móviles presentes). Los subcultivos replicados se guardaron y mantuvieron durante al menos seis meses antes de las extracciones de proteínas y la toma de muestras para inmunofluorescencia.

La secuencia de aminoácidos de BmSWEET1 se dedujo del transcriptoma de B. minutum (GICE01031994) [1]. La masa molecular se calculó utilizando la herramienta ExPASy Compute PI/MW (https://web.expasy.org/compute_pi/). Los supuestos dominios transmembrana se predijeron utilizando los programas Phobius [15] y HMMTOP [16]. Se generó una estructura predicha de BmSWEET1 usando ColabFold [17] y superpuesta con la estructura resuelta de OsSWEET2b de arroz [18] usando ChimeraX [19].

El antisuero contra BmSWEET1 se produjo usando péptidos antigénicos sintéticos (Mimotopes) y los servicios de Walter and Eliza Hall (WEHI) Antibody Facility (Bundoora, VIC). Se generó anti-BmSWEET1 contra el péptido RKKPDENSPVSPS conjugado con hemocianina de lapa californiana y se usó para inmunizar dos conejos diferentes en un programa de inmunización y sangrado de 82 días, que incluía un total de cuatro refuerzos. Las IgG de los sueros de conejo se purificaron usando una columna de afinidad (WEHI) y la inmunorreactividad (eficiencia y especificidad) contra el antígeno se evaluó mediante ELISA (WEHI) y transferencia Western (ver más abajo).

La proteína se extrajo de cultivos de B. minutum como se describe [20] con las siguientes modificaciones. Las células de 20 ml de cultivo se sedimentaron mediante centrifugación a 15.000 rpm durante 1 min y luego se lavaron con FSW. A una segunda centrifugación le siguió una resuspensión con FSW con Triton X100 al 2% (Sigma). Este paso se repitió dos veces. El sedimento se resuspendió adicionalmente con tampón de extracción (Tris 100 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4) suplementado con inhibidor de proteasa (cóctel de PI libre de EDTA completo de Roche). Las células se homogeneizaron utilizando perlas de vidrio lavadas con ácido de 710–1180 mm (Sigma) y un TissueLyser II (Qiagen) durante 90 s a 30 Hz. Se retiraron las perlas y el homogeneizado se centrifugó a 15 000 rpm durante 5 min a 4 °C. Se guardó el sobrenadante y se determinó la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas Qubit, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ThermoFisher).

Se hirvió una muestra de proteína de 20–30 μg (70 °C, 10 min) con tampón de muestra Bolt LDS (ThermoFisher) y agente reductor de muestra Bolt (ThermoFisher) en un volumen total de 40–50 μl. Las proteínas se separaron en Bolt 4–12 % Bis-Tris Plus Gel (ThermoFisher) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana se bloqueó durante la noche con leche desnatada al 5 % en tampón TBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, base Tris 24,8 mM, pH 7,4) que contenía Tween20 al 0,05 % (TTBS). La membrana se transfirió con el anticuerpo primario durante 1 h, luego se lavó tres veces con TTBS durante 5 min y luego se incubó con Amersham ECL anti-IgG de conejo conjugada con peroxidasa de rábano picante (Bio-Strategy). Se realizaron tres lavados adicionales de 5 min antes de exponer la membrana a los reactivos SuperSignal West Pico PLUS durante 5 min (ThermoScientific).

Para verificar la especificidad del antisuero, el suero se preincubó con el antígeno peptídico (proporción molar 1:1) durante 1 h con agitación a temperatura ambiente antes de la transferencia Western como se indicó anteriormente.

Se marcaron tres réplicas de células cultivadas de vida libre y simbióticas (recién aisladas de anémonas [1]) de B. minutum para inmunofluorescencia con anti-BmSWEET1, suero preinmune o sin anticuerpo primario, seguido de lavados y un secundario marcado con fluorescencia. anticuerpo como se muestra a continuación.

Se tomaron muestras de dos ml (~1 × 106 células) de cada uno de los tres matraces repetidos para inmunofluorescencia cuantitativa [16]. Las células se sedimentaron centrifugando a 15.000 rpm, 1 min, y se lavaron con 2 ml de FSW. Las células se fijaron incubando con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Sciences) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM), durante 3 h a 4 °C. Para la permeabilización, las células se incubaron con Triton X100 al 0,1 % en PBS durante 10 min. Las células se sedimentaron y se lavaron tres veces con Tween20 al 0,1 % (Bio-Rad) en PBS (PBST). Luego se logró el bloqueo de la unión inespecífica incubando con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (Sigma) en PBST durante 2 h. Además, el sedimento de células se suspendió con el anticuerpo primario diluido en BSA al 0,1 % en PBST y se incubó durante la noche a 4 °C. Después de tres lavados con PBST, las células se suspendieron con IgG anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 546 (ThermoScientific) 1:500 en BSA al 0,1 % en PBST, durante 2 h, en la oscuridad. Finalmente, las células se incubaron con DAPI (ThermoScientific) 1:100 en BSA al 0,1% en PBST, durante 10 min, en la oscuridad.

Las células simbiontes se aislaron de 20 a 30 anémonas de tamaño mediano del genotipo AIMS3, mediante homogeneización con un homogeneizador de vidrio y múltiples (~ 10) giros a 15 000 rpm, 1 min y lavados con FSW. Este procedimiento minimizó las células huésped en el homogeneizado resultante. El resto del protocolo IFA fue el mismo que el descrito anteriormente para los simbiontes cultivados.

Se cargaron cinco µl de muestra en portaobjetos impresos de PTFE (suministros SPI) con montaje antidecoloración de vidrio ProLong™ (ThermoScientific) y se visualizaron en un microscopio confocal invertido Nikon A1R. Las imágenes se adquirieron usando filtros DAPI y TRITC.

La cuantificación de la intensidad de la señal se logró analizando más las imágenes a través del software Fiji (ImageJ) [21], lo que nos permitió comparar la señal de BmSWEET1 como un indicador de la cantidad de proteína. Células seleccionadas aleatoriamente (al menos 100 células) de cada una de las tres réplicas y cada tratamiento se identificaron en función de su forma, tamaño y autofluorescencia de clorofila. Luego, se determinó la intensidad media de la mancha alrededor de la célula en función de la fluorescencia del anticuerpo secundario. No se observó una diferencia significativa en el grosor de la pared celular para las células de algas de vida libre versus simbióticas (Fig. S1), por lo que asumimos que el acceso a los reactivos de etiquetado es equivalente.

El análisis estadístico para microscopía cuantitativa se realizó usando el software SPSS (Versión 20.0., IBM Corp). Los datos se probaron para normalidad y varianzas iguales. Para distinguir los resultados estadísticamente significativos, utilizamos el análisis ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples post hoc (Tukey HSD) (p < 0,05).

Se realizaron tres controles negativos para inmunofluorescencia. El primero implicó el marcaje con un suero preinmune, que no dio señal (no se muestra). El segundo fue la preincubación del suero con el antígeno peptídico (proporción molar 1:1) durante 1 h con agitación a temperatura ambiente antes de agregar el suero a los portaobjetos, lo que resultó en que no hubiera señal amarilla de BmSWEET1 (no se muestra). El tercer control negativo fue omitir el anticuerpo primario.

Las secuencias de codificación de AtSWEET1 (AT1G21460) y AtSWEET11 (AT3G48740) se amplificaron a partir de ADNc de Arabidopsis thaliana utilizando los cebadores SF46/SF47 y SF52/SF53 (Tabla S1), respectivamente. La secuencia de cDNA de BmSWEET1 se optimizó por codones para Saccharomyces cerevisiae y se sintetizó por Integrated DNA Technologies. Los fragmentos de genes sintetizados se usaron para la PCR con los cebadores SF50/SF51. Los fragmentos de PCR se subclonaron en pJet1.2 (Thermo Fisher Scientific) y se verificaron mediante secuenciación. Después de la digestión con PacI y XhoI, los fragmentos se ligaron en el vector de expresión de levadura pDR195 [22].

La cepa de levadura EBY4000 [hxt1–17D::loxP gal2D::loxP stl1D::loxP agt1D::loxP ydl247wD::loxP yjr160cD::loxP], mutante en múltiples importadores de hexosas [23], se transformó con los diferentes vectores pDR195 – que contiene AtSWEET1, AtSWEET11, BmSWEET1 como inserto, o el vector pDR195 sin inserto, respectivamente, como se describe [24]. Los transformantes se seleccionaron en medio YNB + \({{{\mathrm{NH}}}}_{4^{+}}\), +His, + Trp, +2% Mal, -Ura, y se verificaron mediante PCR.

Para probar la actividad de captación de glucosa, las diferentes cepas de levadura se precultivaron durante la noche en medio YNB (+ His, + Trp, +2 % Mal) a 30 °C, 160 rpm. Para EBY4000, se añadió Ura al medio. Las células se recogieron por centrifugación (2500 × g, 10 min, temperatura ambiente) y se lavaron dos veces con tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). La densidad óptica se ajustó a OD600 = 3. Las cepas de levadura se colocaron como una dilución en serie en placas de medio YNB con o sin Ura y se complementaron con Mal al 2% o Glc como fuente de carbono. Además, se probó el efecto de 0,2% de 2-desoxi-D-glucosa. El crecimiento se documentó mediante fotografía después de 3 días de incubación a 30 °C o 5 días de incubación a 30 °C con Fru como fuente de carbono.

BmSWEET1 (GICE01031994) tiene una gran similitud de secuencia con los miembros de una familia de transportadores conocida como SWEET (los azúcares finalmente se exportarán como transportadores) (Fig. 1A). Los SWEET se descubrieron por primera vez en las plantas [25], donde sus funciones incluyen la exportación de azúcares de las hojas para el transporte hasta las raíces no fotosintéticas, la carga de azúcares en las semillas para dar a las nuevas plantas un comienzo en la vida y la secreción de azúcares en los nectarios de las flores para atraer polinizadores [25, 26]. Desde su descubrimiento inicial en las plantas, los SWEET se identificaron posteriormente en animales [27], hongos [28], protistas [28, 29] y bacterias [28, 29]. Los SWEET eucariotas aparentemente surgieron a través de la fusión de dos medios transportadores procariotas conocidos como semi-SWEET [28]. La estructura de los SWEET eucariotas, con dos haces de triple hélice conectados a través de una hélice enlazadora de inversión (es decir, siete dominios transmembrana) [18, 28], es consistente con la fusión de dos genes semi-SWEET [18, 28]. Los SWEET son uniportadores bidireccionales que facilitan la difusión de azúcares a favor de un gradiente de concentración [25, 30]. En las plantas, los sustratos pueden ser glucosa, fructosa y sacarosa [25, 30].

A Alineación de BmSWEET1 con OsSWEET2b (arroz SWEET2b) que muestra altos niveles de similitud de secuencia (* [asterisco] indica posiciones con residuos totalmente conservados, [dos puntos] indica conservación entre grupos de propiedades muy similares y [punto] indica conservación entre grupos de propiedades débilmente similares [19]). Dos dominios MtN3 en BmSWEET1 se indican con barras rosas. Las hélices transmembrana previstas en BmSWEET1 se indican con texto gris. La tirosina 61 (verde) en la puerta extrafacial de OsSWEET2b (17) se conserva en BmSWEET1, al igual que tres de las cuatro prolinas (rojas) que recubren el túnel del sustrato OsSWEET2b (17). El par de asparagina (n minúscula) en el sitio de selección de sustrato en OsSWEET2b (17) no es evidente en BmSWEET1 a partir de esta alineación. El péptido utilizado para producir suero anti-BmSWEET1 se indica con una línea roja. B Estructura resuelta del arroz OsSWEET2b que muestra siete hélices transmembrana [18]. C Estructura predicha de ColabFold de BmSWEET1 que muestra ocho dominios transmembrana. La posición aproximada del péptido utilizado para generar el antisuero BmSWEET1 se muestra como una línea roja. D Superposición de las estructuras OsSWEET2b (beige) y BmSWEET1 (azul) que muestran una gran colinealidad más un dominio transmembrana N-terminal extra (lado derecho) en BmSWEET1.

BmSWEET1 tiene características de estructura primaria de un DULCE eucariótico típico, a saber, dos dominios MtN3/saliva y siete hélices transmembrana predichas [18, 25]; se predice un posible octavo dominio transmembrana en una extensión N-terminal de BmSWEET1 no compartida con plantas SWEET (Fig. 1A). La alineación [31] de BmSWEET1 con el arroz SWEET2b (OzSWEET2b) muestra un alto nivel de identidad de secuencia (Fig. 1A) y características conservadas como la tirosina en la puerta externa [18, 25] y tres de las cuatro prolinas que se alinean la vía de transporte [18, 25], son evidentes en BmSWEET1 (Fig. 1A). Sin embargo, el par de residuos de asparagina que rodean el sitio de reconocimiento del sustrato de glucosa en OsSWEET2b [18] no es evidente en BmSWEET1 (Fig. 1A). Usamos Alpha Fold [17] para predecir una estructura de BmSWEET1 (Fig. 1C), y comparamos la estructura de la proteína dinoflagelada predicha con la estructura resuelta para el arroz, OsSWEET2b [18] (Fig. 1B). AlphaFold corroboró la existencia de ocho dominios transmembrana en BmSWEET1 (Fig. 1C). La estructura BmSWEET1 predicha es muy similar a la estructura OsSWEET2b [18] con siete hélices transmembrana superpuestas casi exactamente (Fig. 1D). La transmembrana predicha adicional (octava) en la proteína BmSWEET1 se encuentra en el lado derecho de esta vista (Fig. 1C) y daría como resultado que el extremo N fuera interno, lo que contrasta con la proteína de arroz en la que el extremo N es extracelular [ 18]. Queda por determinar qué papel desempeña la transmembrana extra (octava) en BmSWEET1 y si BmSWEET1 existe como un homotrímero como el transportador facilitador de glucosa de arroz [18]. Sin embargo, la similitud de las dos proteínas (Fig. 1D) es notable considerando que los dinoflagelados y las plantas compartieron por última vez un ancestro común hace ~2b años [32]. Según el análisis de secuencias y el modelado de estructuras, consideramos que es muy probable que BmSWEET1 sea un uniportador de azúcar bidireccional con preferencias de sustrato indeterminadas.

Cinco genes similares a SWEET adicionales también son evidentes en los recursos genómicos de B. minutum [2] (Tabla S1). Ninguno de ellos fue aumentado en hospite [1], y no se caracterizan más aquí. Es importante destacar que también encontramos genes similares a SWEET en otros dinoflagelados simbióticos para los cuales hay recursos genómicos disponibles (Tabla S1).

WoLF PSORT predice que BmSWEET1 es una proteína de la membrana celular [33], y nuestro siguiente paso fue localizar la proteína. El antisuero contra un péptido (RKKPDENSPVS) exclusivo de BmSWEET1 (Fig. 1A, C) decora una sola banda con una masa aparente de 54 kDa en transferencias Western de proteínas B. minutum separadas por SDS-PAGE (Fig. 2A). La preincubación del suero con el péptido anuló la unión del suero a esta banda (Fig. 2B), demostrando que el suero es específico para el péptido BmSWEET1. La masa aparente de BmSWEET1 está razonablemente de acuerdo con la masa predicha (35 kDa) considerando que las proteínas de membrana a menudo migran de manera aberrante en SDS-PAGE [34].

A El antisuero peptídico marca una sola banda de masa molecular de 56 kDa en células cultivadas. El marcaje B se anula mediante la preincubación del suero con el péptido antigénico. C Diez células cultivadas de B. minutum marcadas con DAPI en azul. D Antisuero BmSWEET1 en amarillo. E Autofluorescencia de clorofila en rojo. F Iluminación de campo brillante. G Fusión de todos, mostrando BmSWEET1 en la periferia de las células y no asociado con los núcleos o plástidos. H Primer plano de una única célula cultivada de B. minutum teñida con calcofluor para celulosa en magenta. I Misma celda que H marcada para BmSWEET1 en amarillo, J Misma celda que H mostrando autofluorescencia de clorofila en rojo. K Misma celda que H en iluminación de campo claro. L Fusión de calcoflúor y BmSWEET1 que muestra la proteína BmSWEET1 que subtiende principalmente la pared de celulosa. M Micrografía electrónica de una célula de B. minutum que muestra la membrana celular situada justo debajo de la pared celular.

Los ensayos de inmunofluorescencia que utilizan este suero muestran que BmSWEET1 está ubicado en la periferia de las células de dinoflagelados y no está asociado con los núcleos azules teñidos con DAPI (Fig. 2C). BmSWEET1 está distal a la autofluorescencia de clorofila roja que define los plástidos y probablemente no sea una proteína de membrana de cloroplasto (Fig. 2E-J). La tinción conjunta con blanco de calcoflúor, que usamos para teñir la celulosa magenta, revela que la proteína BmSWEET1 está situada en la pared celular externa o justo debajo de ella (Fig. 2H-M), muy probablemente en la membrana celular del dinoflagelado. Concluimos que BmSWEET1 es predominantemente una proteína de membrana celular (membrana plasmática) de B. minutum.

Para determinar si BmSWEET1 es realmente un transportador de azúcar y cuál es su sustrato preferido, aplicamos el ampliamente utilizado ensayo de complementación de mutantes de levadura [18, 25, 26, 28]. El transportador de hexosa de levadura mutante EBY4000 no puede importar glucosa y no crece en agar glucosa [23]. EBY4000 se puede transformar con el plásmido de expresión pDR195, que le conferirá la capacidad de crecer en medios de glucosa si expresa un importador de glucosa. Debido a que los SWEET son facilitadores bidireccionales capaces de transportar azúcares de concentraciones altas a bajas, la levadura que expresa un SWEET funcional puede absorber azúcares selectos del medio [18].

Los transformantes que expresan BmSWEET1, Arabidopsis thaliana SWEET1 (un transportador de glucosa [25]), AtSWEET11 (un transportador de sacarosa de Arabidopsis [26]) y el vector pDR195 vacío (que no contiene ningún gen transportador) se seleccionaron en medio SD sólido con maltosa al 2 % como carbono. fuente a 30 °C durante 4 días, luego se mancharon como una serie de diluciones en placas de maltosa o glucosa, las cuales tenían menos uracilo para seleccionar cepas que contenían pDR195 (pDR195 también expresa orotidina-5′-fosfato descarboxilasa [URA3], que se requiere para la biosíntesis de uracilo).

Todas las cepas crecieron en placas de maltosa suplementadas con uracilo (Fig. 3A). EBY4000 sin transformar no creció en placas de maltosa que carecen de uracilo (Fig. 3B). Como se esperaba, las levaduras de vector vacío (pDR195) pudieron crecer en las placas de maltosa (Fig. 3A, B), pero no en las placas de glucosa (Fig. 3C). De manera similar, las levaduras que expresan AtSWEET11 crecieron en las placas de maltosa (Fig. 3A, B) pero no en las placas de glucosa (Fig. 3C), lo que es consistente con que AtSWEET11 sea un transportador de sacarosa [26]. Por el contrario, la levadura que expresa el conocido transportador de glucosa AtSWEET1 [25] creció en glucosa (Fig. 3C). La levadura que expresa BmSWEET1 también creció en glucosa (Fig. 3C), lo que confirma que BmSWEET1 es un transportador de glucosa.

Una cepa de levadura no transformada EBY4000 y cepas transformadas con el plásmido de expresión pDR195 que alberga el transportador de glucosa de Arabidopsis AtSWEET1, el transportador de sacarosa de Arabidopsis AtSWEET11, o el transportador putativo de B. minutum BmSWEET1, o el vector vacío crecen en placas de maltosa (Mal) suplementadas con uracilo ( ura). B Si se omite el uracilo de las placas de maltosa, los mutantes no transformados (EBY4000) no crecen porque son auxótrofos para el uracilo. C Si la maltosa se reemplaza por glucosa (Glc), solo la levadura que expresa un importador de glucosa puede sobrevivir, a saber, los transformantes AtSWEET1 y los transformantes BmSWEET1. D Por el contrario, si el sustrato de maltosa se complementa con un análogo de glucosa tóxico (2-dexoy-D-glucosa), cualquier cepa competente para importar hexosa (es decir, transformantes AtSWEET1 y transformantes BmSWEET1) morirá, mientras que las cepas incompetentes para importar hexosa (AtSWEET11 y pDR195 vector) pueden crecer usando maltosa y no son envenenados por 2-dexoy-D-glucosa. E Cuando se suministra fructosa (Fru) como fuente de carbono, crecen los transformantes AtSWEET1 (que pueden importar fructosa), al igual que los transformantes BmSWEET1 en menor grado. Las imágenes de toda la serie de placas de dilución se muestran en la Fig. S1.

Como prueba adicional del transporte de glucosa por BmSWEET1, empleamos el análogo tóxico de glucosa 2-desoxi-D-glucosa (Fig. 3D). Los transformantes de levadura sembrados en maltosa más 2-desoxi-D-glucosa mueren si son competentes para la importación de glucosa. Por lo tanto, las levaduras que expresan AtSWEET1 o BmSWEET1 no crecieron en este ensayo, mientras que las que expresaban AtSWEET11 o ningún transportador (vector vacío) crecieron con éxito porque no pudieron absorber el análogo de glucosa tóxico (Fig. 3D).

También probamos la capacidad de BmSWEET1 para transportar fructosa (Fig. 3E). Las levaduras que expresan AtSWEET1 crecieron en fructosa como se esperaba [35], y el crecimiento limitado de levaduras que expresan BmSWEET1 también fue evidente en fructosa (Fig. 3E), lo que indica cierta capacidad de BmSWEET1 para transportar fructosa. Concluimos que el sustrato óptimo del transportador BmSWEET1 es la glucosa.

A continuación, buscamos corroborar la evidencia del transcriptoma de que BmSWEET1 es más abundante cuando las algas son simbióticas dentro de un huésped animal [1, 2] mediante el uso de nuestro antisuero para medir los niveles de proteína. Al igual que otros SWEET, BmSWEET1 aparentemente es un facilitador no regulado de la difusión pasiva, por lo que expresar un exportador de glucosa en el estado planctónico de vida libre parecería una mala adaptación. Es poco probable que las células de vida libre exporten glucosa preciosa al océano, y la fuga de glucosa al medio ambiente también podría atraer a los depredadores algívoros [36]. Por el contrario, se esperaría que las células simbióticas expresaran más BmSWEET1 para cumplir con su parte del 'intercambio de divisas' simbiótico [5].

Intentamos medir la cantidad de BmSWEET1 tanto en las algas de vida libre como en las simbióticas mediante transferencia de Western, pero la falta de anticuerpos contra otras proteínas de dinoflagelados expresadas constitutivamente para usar como control de carga y los altos niveles de fondo en las transferencias de simbiontes aislados (aparentemente causaron por contaminación de anémona) obvió este enfoque. Por lo tanto, decidimos cuantificar el etiquetado de inmunofluorescencia de BmSWEET1 en células individuales, ya sean células B. minutum de vida libre o células simbióticas de la misma cepa recién aisladas de la anémona huésped E. diaphana (Fig. 4).

Células de AC Breviolum minutum cultivadas in vitro. D–F Células de la misma cepa recién aisladas de anémonas huésped. Ambos conjuntos de células se inmunoteñeron para la proteína BmSWEET1 y se tomaron imágenes en paralelo para comparar las intensidades de marcaje. Un marcaje de BmSWEET1 en células de vida libre que muestra un marcaje de BmSWEET1 relativamente débil se representa en amarillo. B Iluminación de campo brillante. C Fusión de todos. D B. minutum célula simbiótica en una anémona huésped que muestra un marcado intenso de BmSWEET1. E Iluminación de campo brillante. F Fusión de todos. La inmunotinción G–J de las dos poblaciones (de vida libre versus en hospicio) se realizó tres veces, y la intensidad del marcado se midió para >100 células (n) y se representó como diagramas de caja/bigotes. G Intensidad de fluorescencia en las células de vida libre. H Intensidad de fluorescencia de las células en hospite. I, J La intensidad de la fluorescencia de fondo se cuantificó en números equivalentes de células preparadas de manera similar pero sin el antisuero primario y es marginalmente menor que la medida para las células de vida libre marcadas con el anticuerpo primario (comparar G).

El etiquetado de anticuerpos y la obtención de imágenes de las dos muestras de algas se realizaron en paralelo con las mismas condiciones y configuraciones del microscopio (Fig. 4A-F). El etiquetado y las comparaciones cuantitativas se realizaron tres veces por separado, y se cuantificó la intensidad fluorescente de> 100 células para cada tratamiento (Fig. 4G-J). El marcaje de referencia/fondo se estableció omitiendo el antisuero BmSWEET1 primario (Fig. 4I, J). La cuantificación muestra que las algas tienen significativamente más proteína BmSWEET1 en hospital (Fig. 4H) que en vida libre (Fig. 4G). Para controlar la accesibilidad diferencial de los anticuerpos a las células de vida libre frente a las células simbióticas recién aisladas, medimos el grosor de la pared celular, lo que mostró que el grosor medio de la pared no difería en los dos grupos (Fig. S2). Los dinoflagelados simbióticos existen a una intensidad de luz más baja (15 μmol m-2 s-1 fotones) que sus homólogos cultivados in vitro de vida libre (60 μmol m-2 s-1 fotones, consulte Materiales y métodos). Para controlar que la intensidad de la luz no afectara la cantidad de proteína BmSWEET1, realizamos inmunofluorescencia en dos cultivos: uno crecido a 60 μmol m-2 s-1 de fotones y otro a 15 μmol m-2 s-1 de fotones. No se observaron diferencias significativas en el etiquetado de inmunofluorescencia de BmSWEET1 a diferentes intensidades de luz in vitro (Fig. S3).

Curiosamente, los niveles de etiquetado en el estado de vida libre (Fig. 4G) son apenas más que los controles negativos en los que se omitió el antisuero primario (Fig. 4I, J), lo que es consistente con nuestra hipótesis de expresión mínima de BmSWEET1 durante este fase de vida para minimizar la exportación de glucosa derrochadora o el peligro de atraer algívoros [36]. Se cree que los factores secretados por el huésped inducen la exportación de carbono fijo de los simbiontes de dinoflagelados [37,38,39], y varios patógenos de plantas pueden regular al alza los DULCES de las plantas para obtener acceso al azúcar del huésped [40], por lo que será interesante determinar qué provoca la mayor expresión de BmSWEET1 en hospite.

Concluimos que BmSWEET1 está regulado al alza, y quizás sea más estable, en algas simbióticas, lo que es consistente con que sea un exportador de glucosa capaz de alimentar a su huésped.

Nos enfocamos en un transportador de glucosa putativo, BmSWEET1, en el dinoflagelado simbiótico B. minutum que previamente se había demostrado que estaba regulado al alza en el nivel de expresión génica en hospital en comparación con la vida libre [1]. El análisis de secuencias y el modelado de estructuras sugirieron que BmSWEET1 es un transportador facilitador de azúcar que ayudaría al azúcar a difundirse a favor de un gradiente de concentración. Localizamos BmSWEET1 en la membrana celular simbionte. Mostramos que BmSWEET1 transporta glucosa al complementar un mutante de levadura deficiente en importación de hexosa. Finalmente, mostramos mediante microscopía cuantitativa que los dinoflagelados de B. minutum que viven dentro de anémonas anfitrionas albergan sustancialmente más BmSWEET1 en sus membranas celulares que las células de vida libre de la misma cepa.

Por lo tanto, BmSWEET1 tiene tres propiedades que lo convierten en un candidato probable para el exportador simbiótico de glucosa en simbiosis de dinoflagelados e invertebrados: i/ ubicación apropiada (membrana celular de algas), ii/ sustrato correcto (glucosa) y iii/ nivel de expresión notablemente más alto en hospital. Con la fotosíntesis de dinoflagelados como fuente de glucosa y la respiración del animal huésped como sumidero de glucosa, BmSWEET1 es una puerta de entrada ideal para facilitar la difusión de glucosa desde el endosimbionte hacia su huésped y, por lo tanto, alimentar a los corales para sustentar la creación de arrecifes de coral.

Los materiales descritos en el manuscrito, incluidos todos los datos sin procesar relevantes, están disponibles gratuitamente a pedido.

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Este estudio recibió el apoyo de Australian Research Council Discovery Grants (DP160101539 para GIM y MvO, DP210100639 para GIM y DP180102630 para MJHvO) y Australian Research Council Laureate Fellowships (FL170100008 para GIM y FL180100036 para MJHvO). APMW y ME agradecen el apoyo de la Fundación Alemana de Investigación, a través de CRC1535 "MiBiNet". Agradecemos a Eckhard Boles por proporcionar la cepa EBY4000.

Genial Maorlanda

Dirección actual: Departamento de Biología Marina, Escuela de Ciencias Marinas Leon H. Charney, Universidad de Haifa, Haifa, Israel

marion eisenhut

Dirección actual: Biología Computacional, Facultad de Biología, CeBiTec, Universidad de Bielefeld, Bielefeld, Alemania

Jade Tortorelli

Dirección actual: Coral Resilience Lab, Hawai'i Institute of Marine Biology, Kāne'ohe, HI, EE. UU.

Escuela de Biociencias, Universidad de Melbourne, Parkville, VIC, Australia

Keren Maor-Landaw, Giada Tortorelli, Allison van de Meene, Madeleine JH van Oppen y Geoffrey I. McFadden

Instituto de Bioquímica Vegetal, Clúster de Excelencia en Ciencias Vegetales (CEPLAS), Universidad Heinrich-Heine, Universitätsstraße 1, D-40225, Düsseldorf, Alemania

Marion Eisenhut, Samantha Kurz y Andreas PM Weber

Plataforma de Microscopía Óptica Biológica, Universidad de Melbourne, Parkville, VIC, Australia

gabriela segal

Instituto Australiano de Ciencias Marinas, Townsville, QLD, Australia

Madeleine JH van Oppen

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KM-L, ME, MJHvO, APMW y GIM contribuyeron al desarrollo conceptual y la versión final editada del manuscrito. KM-L, ME, GT, AvdM, SK y GS realizaron los experimentos. KM-L, ME, MJHvO, APMW y GIM escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Geoffrey I. McFadden.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Maor-Landaw, K., Eisenhut, M., Tortorelli, G. et al. Un transportador candidato que permite a los dinoflagelados simbióticos alimentar a sus anfitriones coralinos. ISME COMÚN. 3, 7 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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Recibido: 02 noviembre 2022

Revisado: 10 de enero de 2023

Aceptado: 18 de enero de 2023

Publicado: 28 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00218-8

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