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Aug 10, 2023

VIH dinámico

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 6393 (2022) Citar este artículo

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Las vacunas dirigidas a la proteína de pico gp160 del VIH-1 se ven obstaculizadas por las altas tasas de mutación viral y las artimañas estructurales. La región externa próxima a la membrana (MPER) de gp160 es el objetivo de los anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAb) que surgen naturalmente, pero las vacunas basadas en MPER no generan bnAb. Aquí, la proteína de punta incrustada en nanodisco se investigó mediante criomicroscopía electrónica y simulaciones de dinámica molecular, lo que reveló una inclinación espontánea del ectodominio que crea vulnerabilidad para el VIH-1. Mientras que cada protómero MPER irradia centralmente hacia el eje triple que contribuye a una estructura de trípode asociada a la membrana que se ocluye en la punta vertical, la inclinación proporciona acceso al MPER opuesto. Las estructuras de las proteínas de espiga con 4E10 bnAb Fabs unidos revelan que el anticuerpo se une a MPER expuesto, alterando así la dinámica de MPER, modificando la inclinación promedio del ectodominio e imponiendo tensión en la membrana viral y los segmentos transmembrana de la espiga, lo que da como resultado la anulación de la fusión de membrana e informando el futuro desarrollo de vacunas.

Se cree que la génesis del virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) como patógeno en el Homo sapiens ocurrió en la República Democrática del Congo alrededor de 1920 como consecuencia del salto del retrovirus del chimpancé al humano, seguido del inicio de la epidemia actual en la década de 19701,2. Como prueba de la importancia de esta zoonosis, los datos recopilados en los últimos 35 años indican que aproximadamente 78 000 000 de personas en todo el mundo se han infectado y aproximadamente 35 000 000 han muerto a pesar de la terapia con fármacos antivirales de agentes múltiples3.

La proteína trimérica gp160 HIV-1 con punta de envoltura (Env), una glicoproteína transmembrana que comprende tres protómeros, cada uno de gp120 y gp41, es la proteína singular derivada del virus en el virión. Por lo tanto, es el único objetivo de los anticuerpos protectores que surgen de forma natural en los pacientes o que pueden obtenerse en individuos no infectados a través de la vacunación4,5,6. Dicho esto, la inducción de la vacuna de anticuerpos con la amplitud requerida contra diversas cepas virales, los llamados anticuerpos ampliamente neutralizantes (bnAbs), no ha logrado generar anticuerpos que bloqueen la unión inicial del virus a las células T CD4 humanas o que inhiban los cambios conformacionales posteriores de Env y eventos de fusión concomitantes requeridos para la entrada viral posterior a la unión en la célula huésped (revisado en la referencia 7). El reconocimiento inmunológico de Env se ve obstaculizado por su extraordinaria variabilidad de secuencia8, glicosilación densa9,10 y enmascaramiento conformacional de sitios clave y estado metaestable11. No obstante, algunos pacientes con infección crónica por VIH-1 desarrollan bnAbs durante años de infección4,5,6. La diversificación viral concomitante y las extensas mutaciones somáticas de anticuerpos mejoran la afinidad de unión, optimizando la coincidencia entre paratopos y epítopos12. Los BnAb se dirigen contra el sitio de unión a CD4, así como contra los sitios de glucano V1V2 y V3 en gp120, la región de interfaz gp41-gp120 y la región externa proximal a la membrana gp41 (MPER)4,5,6. El MPER, que conecta el ectodominio Env con su dominio transmembrana (TM), se encuentra entre los segmentos de VIH-1 más conservados en las cepas del clado13. Esa conservación y la observación de que los bnAbs dirigidos a MPER que surgen naturalmente manifiestan la amplitud de neutralización más amplia han designado a MPER como un objetivo clave para el diseño de vacunas.

La estructura del MPER por sí mismo y junto con el dominio TM en un entorno mimético de membrana ha sido estudiada extensamente por métodos espectroscópicos, estableciendo que el péptido MPER tiende a adoptar una conformación de hélice-bisagra-hélice torcida incrustada en la membrana con flexibilidad flanqueante adicional13 ,14 y sugiriendo que el MPER unido a bnAb se extrae parcialmente de la membrana15. Sin embargo, las vacunas de péptido MPER no han logrado provocar bnAbs y la disposición exacta del MPER como parte de todo el trímero Env integrado en la membrana sigue siendo controvertida. Un estudio de tomografía crioelectrónica (crio-ET) informó que los MPER forman una estructura similar a un trípode compuesta por tres hélices separadas16, pero otros estudios de crio-ET mostraron que los tres segmentos MPER están organizados en un tallo compacto17,18. Por lo tanto, para fines de diseño de vacunas racionales, se necesita una estructura de alta resolución para dilucidar la disposición real del MPER en el contexto de una bicapa lipídica y el ectodominio completo y glicosilado del trímero Env.

Aquí, reconstituimos la proteína Env del VIH-1 expresada en células de mamíferos en nanodiscos de lípidos y usamos microscopía crioelectrónica de una sola partícula (crio-EM) para determinar su estructura sola y en complejo con hasta tres Fab del bnAb 4E10. Junto con las simulaciones de dinámica molecular de grano grueso (CGMD), estas estructuras revelan la dinámica del ectodominio Env y el MPER en la membrana. Además, se determinan los cambios conformacionales en el MPER junto con las perturbaciones inferidas en los lípidos vecinales y los dominios TM que acompañan a la unión de un número creciente de estos Fab 4E10.

El gp145 SOSIP construct19 de la proteína de punta Env de la cepa BG505 clado A, que consta del ectodominio completo (residuos 1–662), los segmentos MPER y transmembrana y 17 residuos del dominio citoplasmático (Fig. 1a), se expresó en HEK293 células. Se usó la construcción de Env truncada en el extremo C-terminal debido a su expresión mucho mejor en comparación con la proteína de longitud completa. Después de la purificación en dodecil maltósido (DDM) utilizando PG9 Fab para cromatografía de afinidad seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Fig. 1a, b complementaria), la gp145 recombinante se reconstituyó en nanodiscos con una mezcla molar 1,5:1:1,07 de palmitoil oleil fosfatidilcolina (POPC), palmitoil oleil fosfatidilglicerol (POPG) y extracto de lípidos polares de cerebro. Esta mezcla de lípidos tiene una composición similar a la de la membrana del VIH-120, excepto que le falta colesterol. Aunque el colesterol es el componente más abundante del lipidoma del VIH-1, nuestras simulaciones de CGMD realizadas con una membrana que contiene un 20 % de colesterol mostraron un comportamiento dinámico del ectodominio, en particular, los ángulos de inclinación, en consonancia con los observados en nuestros mapas crio-EM (ver abajo). Los nanodiscos vacíos fueron eliminados por SEC (Fig. 1a complementaria). El análisis SDS-PAGE de la fracción máxima de SEC confirmó la presencia tanto de gp145 como de la proteína de andamiaje de membrana MSP1D1dH5, que se usó para el ensamblaje de nanodiscos (Fig. 1b complementaria). Las imágenes EM de gp145 teñidas negativamente en DDM mostraron en su mayoría vistas superiores simétricas triples de gp145 (Fig. 1c complementaria), mientras que las imágenes EM de tinción negativa de gp145 incrustada en nanodisco mostraron vistas laterales y revelaron los nanodiscos (Fig. 1d complementaria). A continuación, se incubó gp145 incrustada en nanodisco con el fragmento Fab de bnAb 4E10, se entrecruzó con BS3 y se vitrificó en rejillas. El procesamiento de imágenes con RELION-3 mostró que ~80 % de las partículas seleccionadas no tenían una densidad obvia para el 4E10 Fab. El procesamiento adicional de estas partículas produjo un mapa de densidad de gp145 incrustado en nanodisco con una resolución general de 3.9 Å (Fig. 1b y Figs. Suplementarias 2-4). Este mapa nos permitió construir un modelo atómico para los residuos de ectodominio 31–662 y un modelo de columna vertebral para los residuos 663–671 (consulte "Métodos" para obtener más detalles). El mapa no resolvió las hélices transmembrana, que tampoco se resolvieron en un mapa anterior de proteína Env21 de longitud completa integrada en nanodisco, muy probablemente como resultado de variaciones en la posición de los dominios TM de un solo tramo en relación con el nanodisco. Sin embargo, la densidad adicional de baja resolución (~5 Å; Fig. 4b complementaria) representó el comienzo del segmento MPER-N, en el que colocamos el segmento N-terminal de una estructura de RMN de MPER (PDB: 2PV6)14 ( Fig. 4d complementaria), lo que revela la disposición del MPER en el contexto de una membrana y el ectodominio Env trimérico. Los segmentos MPER-N de cada protómero forman tres hélices independientes que adoptan una conformación similar a un trípode (Fig. 1b, c), que difiere de las estructuras reportadas anteriormente en las que los MPER convergen16 o forman un tallo compacto17,18.

una arquitectura de dominio de gp160. FP, péptido de fusión; NHR, repetición heptada N-terminal; CHR, repetición de heptada C-terminal (naranja); MPER-N (verde); MPER-C (magenta); TM, dominio transmembrana; CT, cola citoplasmática. Los números de arriba indican los primeros residuos de los segmentos y los números de abajo el último. b Izquierda: mapa Cryo-EM de gp145 integrado en nanodisco a un nivel de contorno bajo (0,011). La densidad del nanodisco se muestra en amarillo claro. Derecha: mapa Cryo-EM de gp145 incrustado en nanodisco en un nivel de contorno superior (0,014) que se muestra en gris semitransparente, con la estructura gp145 modelada, que se muestra en representación de cinta, encaja en el mapa. La región CHR se muestra en naranja y el segmento MPER-N en verde. El resto del ectodominio se muestra en azul. c Izquierda: Estructura de gp145 vista paralela (arriba) y perpendicular al plano de la membrana (abajo). Derecha: Mismas vistas que en el panel izquierdo después de agregar la estructura NMR del MPER completo (PDB: 2PV6) a nuestro modelo gp145 (basado en una superposición de los segmentos MPER-N). La región CHR se muestra en naranja, el segmento MPER-N en verde y el segmento MPER-C en magenta. d Colocación de las dos estructuras de RMN disponibles de MPER-TM en el mapa crio-EM (colocado en función de la posición de los segmentos de MPER-N). La estructura de trípode (PDB: 6DLN) encaja bien en el mapa (izquierda), mientras que los segmentos MPER-N de la estructura de tallo-burbuja (PDB: 6E8W) se corresponden mal con el mapa crio-EM ya que las hélices transmembrana sobresalen lejos del densidad de nanodisco (derecha). e Tres mapas crio-EM de gp145 integrada en nanodisco que muestran que el ectodominio gp145 adopta una amplia gama de ángulos con respecto al plano de la membrana. Los mapas se muestran como superficies semitransparentes y la estructura del ectodominio como cintas de colores. Las distancias se midieron desde el final del ectodominio (residuo Ala662) hasta el centro del nanodisco (indicado por la línea discontinua).

Nuestra estructura indica que el segmento MPER-N está parcialmente enterrado en la bicapa lipídica (Fig. 1b), de acuerdo con una estructura de RMN anterior que mostró que el MPER formaba segmentos helicoidales inmersos en la membrana14. Debido a una bisagra que conecta el MPER-N con las hélices MPER-C14 y la falta de densidad confiable para el segmento MPER-C y la región TM, nuestro mapa no informa sobre la posición de los segmentos MPER-C o la organización de las hélices TM. Dicho esto, como se analiza a continuación, es probable que cada segmento MPER-C se extienda hacia el centro del trímero Env y que los dominios TM vinculados a MPER de cada protómero se aproximen cerca del eje del trímero triple en una asociación suelta o , alternativamente, uno relacionado con el paquete TM observado en dos estructuras de RMN de MPER-TM22,23. Es de destacar que otros estudios implican que las hélices TM en la punta del trímero nativo no forman un trímero rígido24, pero podrían pasar a una configuración de este tipo durante el proceso de fusión viral. En una de las estructuras de RMN (PDB: 6E8W)22, los segmentos MPER-C forman hélices algo continuas con sus respectivos dominios TM, aunque las hélices MPER-C están distorsionadas y se doblan alejándose del eje triple. La región bisagra entre los segmentos MPER-C y -N luego forma fuertes torceduras, lo que da como resultado que los segmentos MPER-N se aproximen al eje de tres pliegues. Nos referiremos a esto como la conformación de tallo-burbuja. En la otra estructura de RMN (PDB: 6DLN)23, son las bisagras entre TMD y MPER-C las que forman torceduras fuertes, mientras que los segmentos MPER-C y -N forman una hélice continua que se extiende alejándose de la hélice triple, formando una conformación de trípode.

Para comparar la conformación del MPER en el contexto del trímero Env completo, medimos la distancia entre el extremo N-terminal de los segmentos MPER, es decir, el átomo Cα del residuo Lys665, entre protómeros adyacentes. En nuestra estructura crio-EM, la distancia es de 30 Å, mientras que la distancia es de 53 Å en la estructura de trípode de RMN y de 16 Å en la estructura de burbuja de tallo de RMN (Fig. 5a complementaria). La medición estableció que los segmentos MPER en nuestra estructura adoptan una conformación entre las dos estructuras NMR. Sin embargo, los residuos de Trp666 de los tres protómeros MPER-N convergen en la conformación de tallo-burbuja para formar un núcleo hidrofóbico, lo que no es el caso en la estructura crio-EM (Figura complementaria 5b). Además, al colocar las dos estructuras de RMN en el mapa crio-EM, usando los segmentos MPER-N como puntos de anclaje, la dimensión de la estructura del trípode de RMN encaja mucho mejor en el mapa, estableciendo que esta estructura está más cerca de la conformación MPER en el contexto de toda la proteína Env (Fig. 1d). La diferencia restante en la conformación de MPER entre la estructura de trípode de RMN y nuestra estructura crio-EM probablemente se deba a las restricciones impuestas al MPER por el ectodominio, que estaba presente en el estudio de crio-EM pero faltaba en el estudio de RMN.

El procesamiento de datos de la gp145 integrada en nanodiscos reveló que el ectodominio puede adoptar una amplia gama de ángulos con respecto al plano de la membrana. Para caracterizar mejor el rango de inclinación del ectodominio, realizamos clasificaciones 3D iterativas (Fig. 3 complementaria), lo que resultó en 20 mapas con una densidad bien definida para el nanodisco y características suficientes en la densidad del ectodominio para acoplar sin ambigüedades el modelo atómico (los ejemplos se muestran en Figura 1e). Una película generada a partir de los modelos acoplados ilustra el grado de inclinación que puede sufrir el trímero Env en relación con la membrana del nanodisco (Película complementaria 1). Los mapas muestran que el eje triple del ectodominio puede inclinarse hasta al menos 30 ° desde la membrana normal (Fig. 1e y Película complementaria 2). Como resultado de la inclinación, la distancia del ectodominio desde la superficie de la membrana aumenta hasta en 20 Å (Fig. 1e).

Para comprender mejor la dinámica del ectodominio en la membrana, utilizamos simulaciones CGMD (Fig. 2a). gp145 se incrustó en una bicapa de POPC que contenía un 20 % de colesterol, ya que se sabe que la membrana del VIH-1 es rica en colesterol20. Las simulaciones corroboraron los resultados de crio-EM en el sentido de que el ectodominio es muy móvil (Película complementaria 3) y puede inclinarse hasta ~63°. A partir de cinco simulaciones de 10 μs, el ectodominio tiene una inclinación promedio de 17,6 ° ± 10,0 °, pero asume una amplia gama de inclinaciones (Fig. 2b). Las simulaciones de CGMD también muestran que los MPER son muy dinámicos y ocasionalmente abandonan el plano de la membrana (Película complementaria 3), pero no hay indicios de que los movimientos de MPER estén correlacionados con la inclinación del ectodominio. La conversión de instantáneas CGMD a vistas atomísticas también mostró que las altas inclinaciones del ectodominio per se no favorecían la extracción del MPER de la membrana (Fig. 2c).

a El sistema de gp145 integrado en membrana utilizado para simulaciones de dinámica molecular de grano grueso (CGMD). El ectodominio gp145 se muestra en gris, CHR en naranja, MPER-N en verde y MPER-C en magenta. La bicapa lipídica se muestra en amarillo. b Gráfico que muestra la distribución de los ángulos de inclinación adoptados por el ectodominio gp145, que resume los datos de las cinco repeticiones. La línea sólida representa la media y la banda gris indica la desviación estándar. La línea vertical a 18° es la inclinación promedio general del ectodominio. c Dos instantáneas de las simulaciones CGMD convertidas en vistas de todos los átomos que muestran dos ectodominios gp145 muy inclinados. La inclinación del ectodominio no parece correlacionarse con el segmento MPER-C opuesto (flecha) sumergido en lípidos (panel superior) o expuesto (panel inferior).

Los resultados de CGMD indicaron que la unión de bnAb específico de MPER a gp145 depende de dos dinámicas independientes, (1) la inclinación del ectodominio para hacer que el MPER sea estéricamente accesible para el Fab y (2) los movimientos de MPER que exponen suficientemente el epítopo de la membrana a favorecen la unión de Fab. Nuestro uso del bnAb 4E10 estructuralmente bien caracterizado que reconoce la bisagra MPER y la hélice C25,26 hizo posible probar esta noción. La incubación de la gp145 incrustada en nanodisco con un exceso molar de 100 veces del Fab 4E10 dio como resultado que ~20 % de los ectodominios vitrificados se unieran a al menos una molécula de Fab. Los promedios de proyección obtenidos por clasificación 2D de partículas teñidas negativamente revelaron que de uno a tres Fab podrían unirse a un gp145 (Fig. 3a). Después de un extenso procesamiento de las partículas unidas a Fab vitrificados, pudimos generar mapas de densidad de gp145 incrustada en nanodisco en complejo con un Fab 4E10 (gp145•1Fab) a una resolución de 8,8 Å, con dos Fab 4E10 (gp145•1Fab) con una resolución de 8,2 Å y con tres 4E10 Fab (gp145•1Fab) con una resolución de 3,7 Å (Fig. 3b y Fig. 2 complementaria). A pesar de la resolución limitada de dos de los mapas, que es de solo ~12 Å en la región de unión de Fab (Fig. 4b complementaria), las características de la densidad adicional revelaron que representan Fab unidos y permitieron acoplar el cristal Fab 4E10 estructura (PDB: 1TZG)25 (Fig. 6 complementaria). Sorprendentemente, los mapas revelan dos modos distintos en los que el Fab 4E10 específico de MPER se une a gp145. El mapa gp145•1Fab ilustra el modo de unión 1, en el que el Fab se extiende desde el nanodisco casi paralelo a la superficie de la membrana pero ligeramente alejado del plano de la membrana en la misma dirección que el ectodominio y con el plano del Fab paralelo al del membrana. En el mapa gp145•2Fab, un Fab 4E10 también muestra el modo de unión 1, pero el segundo Fab está unido en el modo 2, en el que el Fab se extiende en la dirección opuesta al ectodominio, ocupando un espacio que normalmente sería el del lípido. bicapa. Además, el plano del Fab gira ~90° y, por lo tanto, es casi perpendicular al plano de la membrana. Finalmente, en el mapa gp145•3Fab, los tres Fab están unidos a gp145 en el modo de unión 2. Como los tres Fab ahora ocupan el espacio que normalmente ocuparía la membrana, este mapa no muestra ninguna densidad que represente el nanodisco.

una imagen EM de tinción negativa representativa de gp145 incrustada en nanodisco después de la incubación con Fab 4E10 (izquierda) y promedios de clase 2D que muestran gp145 con uno a tres Fab 4E10 unidos (derecha). Barra de escala: 50 nm; longitud lateral de las medias: 34 nm. b Mapas crio-EM de gp145 con uno, dos y tres Fabs 4E10 unidos. Los mapas se segmentaron automáticamente con el comando "zona de color" en Chimera. El ectodominio y el nanodisco están coloreados en gris claro y los Fabs 1 a 3 están coloreados en amarillo, dorado y marrón, respectivamente. Los asteriscos indican la densidad que representa el PG9 Fab utilizado para la purificación.

Para analizar los mapas de resolución media de gp145 integrado en nanodisco en complejo con uno y dos Fab 4E10, acoplamos el Fab 4E10 en complejo con el péptido MPER-C (PDB: 1TZG) 25 (Fig. 6 complementaria). La larga región determinante de complementariedad 3 en la cadena pesada (CDRH3) de 4E10 es altamente hidrofóbica, y 4E10 utiliza sus bucles CDRH1 y CDRH3 para unir lípidos26, lo que implica que esas CDR forman una superficie de interacción con la bicapa lipídica. En nuestra estructura de gp145 incrustada en nanodisco por sí misma, el ectodominio está orientado perpendicular al plano de la membrana (Fig. 4a). Sin embargo, para que 4E10 Fab pueda unirse a gp145, el ectodominio debe estar inclinado ~25° (Fig. 4b). Recientemente se ha observado un ángulo de inclinación similar en una estructura crio-EM de la proteína Env de longitud completa de la cepa AMC011 en complejo con el Fab de VRC42.0121. El ectodominio en nuestra estructura gp145•2Fab mostró un ángulo de inclinación similar de ~25° (Fig. 4c). También medimos la distancia del ectodominio gp145 desde la superficie de la membrana. Para gp145 por sí mismo, la distancia entre Glu662 (el final de la repetición de la heptada C-terminal; CHR) y Trp666 (el comienzo del MPER sumergido en la membrana) es ~ 10 Å. En la estructura gp145•1Fab, esta distancia aumenta a ~20 Å. En la estructura gp145•2Fab, la distancia aumenta aún más hasta ~40 Å para el segundo Fab. Encontramos una distancia similar de ~40 Å cuando acoplamos los modelos atómicos de Env y el complejo del Fab 10E8 unido a su epítopo MPER (PDB: 4U6G) en el mapa crio-EM publicado del ectodominio Env de la cepa AMC011 con dos Fab 10E8 enlazados (Fig. 4d)21. En conjunto, estos hallazgos muestran que el ectodominio Env en complejo con bnAbs dirigidos a MPER se inclina y se separa de la membrana.

a El modelo crio-EM de gp145 por sí mismo (ectodominio en gris, CHR en naranja y MPER-N en verde) con segmentos MPER-C agregados de una estructura de RMN (PDB: 2PV6) que muestra que los MPER están incrustados en membrana y la distancia del ectodominio (residuo Ala662) desde la superficie de la membrana es ~10 Å. b Modelo de gp145 con un enlace Fab 4E10 (coloreado en amarillo), que muestra que el ectodominio está inclinado, aumentando su distancia de la membrana a ~20 Å, y que el segmento MPER-C (magenta) debe estar expuesto y orientado aproximadamente perpendicular al plano de la membrana (modo de unión 1). c Modelo de gp145 con dos Fab 4E10 unidos (coloreados en amarillo y dorado), que muestra que el ectodominio permanece inclinado y que los dos Fab se unen de manera muy diferente. Mientras que un Fab muestra el mismo modo de unión 1 que en el panel (b), el segundo Fab eleva el segmento MPER-C a ~40 Å de la membrana, donde corre aproximadamente paralelo a la membrana (modo de unión 2); este Fab ocupa el espacio normalmente ocupado por la membrana. d Modelo de gp160 con dos Fab unidos de bnAb 10E8 (coloreado en azul) generado acoplando la estructura cristalina del complejo de epítopos 10E8 Fab-MPER (PDB: 4U6G) en el mapa crio-EM de 10E8 Fab unido a la proteína Env de la cepa AMC011 (EMDB: 21334). El modelo muestra que el ectodominio no está inclinado y aún ~40 Å lejos de la superficie de la membrana y que ambos Fab 10E8 se unen a MPER-C de manera similar al modo de unión 4E10 1. La estructura crio-EM de gp145 con tres Fab 4E10 unidos (coloreados amarillo, dorado y marrón) vistos paralelos (arriba) y perpendiculares al plano de la membrana (abajo). Aunque se unen asimétricamente, los tres Fab muestran el modo de unión 2. El código de colores es el mismo que en las Figs. 1–3.

El segmento MPER-C (residuos 674–683) unido por el Fab 4E10 adopta una orientación sustancialmente diferente que en el estado no unido. En nuestra estructura de gp145 incrustada en nanodisco, los segmentos MPER-C deben correr en su mayoría paralelos a la membrana y estar parcialmente sumergidos en la bicapa lipídica (Fig. 4a). Por el contrario, nuestro modelo para el complejo gp145•1Fab indica que el segmento MPER-C unido por el primer Fab en el modo de unión 1 se extrae de la membrana, con el extremo C-terminal del MPER permaneciendo cerca de la superficie de la membrana pero el El segmento MPER-C ahora se orienta en un ángulo de ~80° con respecto al plano de la membrana (Fig. 4b). La unión del segundo Fab en el modo de unión 2 da como resultado una mayor eliminación del segmento MPER-C que ahora corre casi paralelo a la membrana pero a una distancia cercana a 40 Å (Fig. 4c). Esta posición del segmento MPER-C requeriría la extracción de la hélice TM y, por lo tanto, es poco probable que ocurra in situ, pero implica que la unión de Fab ejerce una fuerza de tracción sustancial en la hélice TM, lo que probablemente provoque una alteración de la región transmembrana. y posiblemente incluso alguna extracción de la hélice fuera de la membrana. Es de destacar que la drástica reorientación del segmento MPER-C que se observa en la unión del segundo Fab en el modo de unión 2 no se observa en la estructura modelada del ectodominio Env con dos Fab 10E8 unidos (Fig. 4d). En esta estructura, ambos segmentos MPER-C adoptan una conformación como la observada para los Fab 4E10 unidos en el modo de unión 1 en las estructuras gp145•1Fab y gp145•2Fab. La diferencia en las estructuras unidas a 4E10 y 10E8 puede estar relacionada con la mayor hidrofobicidad y unión a lípidos de la superficie de interacción con la membrana de 4E1014,27 y/o con el dominio C-terminal truncado de gp145 utilizado para la formación de complejos con 4E10.

La resolución de 3,7 Å del mapa gp145•3Fab nos permitió construir un modelo atómico para el ectodominio, así como el MPER completo para una de las subunidades y modelos de columna vertebral para los MPER de las otras dos subunidades, revelando así cómo el MPER es conectado al primero (Fig. 4e, Figs. Complementarias 4f y 7a). Sin embargo, no observamos densidad para el nanodisco o las hélices TM, lo que sugiere que la unión de tres 4E10 Fab da como resultado la extracción completa del trímero del nanodisco. La medición directa previa de la unión de Fab 4E10 al péptido MPER en liposomas miméticos del virus del VIH-1 mediante calorimetría de titulación isotérmica reveló un cambio de entalpía de −25 kcal/mol14. Ese proceso exotérmico en asociación con una constante de unión débil de 1,0 μM Kd determinada por resonancia de plasmón superficial sugiere una penalización entrópica significativa. Si bien actualmente no tenemos mediciones energéticas directas para la extracción de gp41 TM por 4E10 en el contexto de nanodisco, los métodos de microscopía de fuerza atómica de molécula única revelan que incluso las proteínas transmembrana de múltiples pasos se pueden desplegar y extraer de la membrana a fuerzas (pN ) a la par o por debajo de las mediadas por moléculas de adhesión28. Aunque nuestro mapa gp145•3Fab (que se describe con más detalle en Material complementario) representa claramente una situación artificial, nos permite sacar dos conclusiones. Primero, en el contexto del ectodominio, el epítopo MPER reconocido por el 4E10 bnAb permanece en la misma conformación que se observa en la estructura cristalina del 4E10 Fab en complejo con el péptido MPER (Fig. 7b complementaria)26. En segundo lugar, la extracción completa de la membrana del trímero Env tras la unión de tres Fab 4E10 ilustra la tensión que ejerce la unión 4E10 en el dominio transmembrana, lo que puede explicar la apariencia distorsionada del nanodisco en nuestro mapa gp145•1Fab (Fig. 3b).

Para comprender el efecto de la unión de bnAb en la dinámica de Env, analizamos las simulaciones CGMD de la gp145 integrada en la membrana y convertimos instantáneas de ectodominios altamente inclinados en modelos atomísticos. En muchos de los modelos, la conformación del segmento MPER-C era demasiado diferente de la que se observa en la estructura cristalina del complejo 4E10 Fab para permitir un acoplamiento inequívoco (Fig. 8a complementaria). Este hallazgo sugiere que el epítopo 4E10 puede estar solo ocasionalmente en una conformación óptima para la unión de anticuerpos. Alternativamente, o además, es concebible que las interacciones iniciales del anticuerpo puedan ser solo con una parte de su epítopo como se sugirió anteriormente13 y que esto luego catalice el plegamiento de todo el segmento MPER-C para permitir la participación completa del Fab con todo su epítopo como se ve en la estructura cristalina 25,26. Además, en casi todos los modelos, el segmento MPER-C se orientó de tal manera que el acoplamiento del Fab 4E10 resultó en que el Fab se incrustara parcialmente en la membrana o en choques estéricos con el ectodominio (Fig. 8b complementaria). Sin embargo, una instantánea mostró el segmento MPER-C en una orientación similar a la que se ve en nuestra estructura gp145•1Fab y su conformación permitió acoplar el 4E10 Fab (Fig. 5a). Las simulaciones de CGMD del complejo gp145•1Fab incrustado en la membrana mostraron que el ectodominio asumía un rango de ángulos similarmente amplio como se ve en ausencia del 4E10 Fab (Fig. 5b y Película complementaria 4), pero con un ángulo de inclinación promedio de 28.7 ° ± 12,0°, diferente al del ectodominio sin ligando (17,6° ± 10,0°). Además, mientras que los tres segmentos MPER-C en el gp145 sin ligando tienen una inclinación promedio de 29.0° ± 20.7° (Fig. 9 complementaria) pero parecen moverse independientemente uno de otro (Fig. 5c y Fig. 10 complementaria), en el En el caso de 10E8 Fab-bound gp145, los segmentos MPER-C tienen ángulos más distintos (Fig. 5d y Fig. 11 complementaria). El MPER-C unido a Fab se estabiliza con una inclinación alta de 64,9° ± 10,4°, similar a la derivada del mapa crio-EM, ~80° (Fig. 4b), mientras que el MPER vecino adopta una inclinación intermedia de 42,5° ± 15,3°, potencialmente suficiente para facilitar la unión de un segundo Fab, y el último MPER asume un ángulo de inclinación bajo de 20,6° ± 12,7°, similar al de los segmentos MPER-C en la gp145 sin ligando.

a El sistema de gp145 incrustado en membrana con 4E10 Fab unido utilizado para simulaciones de dinámica molecular de grano grueso (CGMD). El ectodominio gp145 se muestra en gris, CHR en naranja, MPER-N en verde y MPER-C en magenta. El Fab unido se muestra en dorado y la bicapa lipídica en amarillo. b Gráfico que muestra la distribución de los ángulos de inclinación adoptados por el ectodominio gp145 unido a Fab 4E10, que resume los datos de las cinco repeticiones. La línea sólida representa la media y la banda gris indica la desviación estándar. La línea vertical a 29° es la inclinación promedio general del ectodominio. c Ángulos de los tres segmentos MPER-C en relación con el plano de la membrana adoptado a lo largo del tiempo en una de las simulaciones CGMD de gp145 sin ligando, que ilustran los movimientos altamente dinámicos y no correlacionados de los tres segmentos (consulte la Fig. 10 complementaria para obtener datos de todas las repeticiones) . d Ángulos de los tres segmentos MPER-C adoptados a lo largo del tiempo en una de las simulaciones CGMD de 4E10 Fab-bound gp145, que ilustran que la unión Fab estabiliza los tres segmentos MPER-C en diferentes ángulos promedio (consulte la Fig. 11 complementaria para obtener datos de todos se repite).

Nuestras estructuras de gp145 incrustado en nanodisco por sí mismo y en complejo con hasta tres 4E10 Fab arrojan luz sobre los requisitos previos y las consecuencias de la unión de bnAb al MPER (Fig. 6a). Durante la mayor parte del tiempo, el ectodominio Env altamente glicosilado protegerá al MPER cuyo epítopo bnAb está inmerso en la membrana en gran medida. Sin embargo, nuestros análisis crio-EM y CGMD revelan que el ectodominio puede adoptar una amplia gama de ángulos con respecto a la membrana. En un ángulo de inclinación de ~25° (el ángulo visto en el mapa crio-EM de gp145 unida a Fab 4E10) o superior, que ocurre durante ~24 % del tiempo (deducido de las simulaciones CMGD de gp145 sin ligando), un MPER se vuelve accesible a la unión de Fab, que también e independientemente requiere que el epítopo tenga suficiente exposición en la membrana y adopte una conformación que permita al menos interacciones de unión iniciales con el anticuerpo. Después de la unión del anticuerpo con el MPER parcialmente expuesto, la unión completa estabilizará el MPER en una configuración extraída de la membrana, lo que interrumpirá los movimientos independientes y comparables de los protómeros MPER que, de lo contrario, facilitarían los procesos de hemifusión y fusión aguas abajo (ver más abajo). La superposición de los Fab unidos al epítopo de otros bnAb dirigidos a MPER con el Fab 4E10 guiado por sus respectivos epítopos sugiere que este puede ser un principio general para la actividad neutralizante de estos bnAb (Fig. 6b). La unión de anticuerpos también interfiere con la función de Env al ejercer tensión sobre los dominios transmembrana. Si bien nuestros mapas no revelan el efecto que tiene esta tensión en los dominios TM, un estudio anterior propuso que la unión de anticuerpos podría interrumpir el supuesto haz helicoidal formado por los dominios TM21. Además, la capacidad de los bnAb anti-MPER para unirse a configuraciones de Env sin ligando y unidas al receptor y el estado intermedio previo a la horquilla (Fig. 12 complementaria) proporciona una ventana de tiempo extendida para mediar en la neutralización viral.

El ectodominio gp145 se muestra en gris, CHR en naranja, MPER-N en verde, MPER-C en magenta y el dominio transmembrana en azul claro. La bicapa lipídica se muestra en amarillo pálido/marrón y el anticuerpo en amarillo brillante. a En la orientación vertical de la proteína Env, el epítopo MPER para bnAb 4E10 (indicado por *) está ocluido por el ectodominio, lo que lo hace inaccesible para el bnAb, y la mayor parte del tiempo no está expuesto sino enterrado en la membrana. La inclinación del ectodominio hace que el MPER opuesto sea accesible transitoriamente y si esto coincide con al menos una exposición parcial del epítopo, el bnAb puede realizar las primeras interacciones. La unión completa de anticuerpos altera el movimiento de MPER en la membrana y crea tensión en los dominios transmembrana, lo que evita los cambios conformacionales adicionales necesarios para la fusión de la membrana. b Alineación estructural de Fabs de bnAbs dirigidos a MPER unidos a HIV-1 Env. Los Fab de bnAbs 4E10 (PDB: 4XC3), DH511 (PDB: 5U3N), 10E8 (PDB: 4U6G) y PGZL1 (PDB: 6O3J) se alinearon según el epítopo consenso MPER (magenta), lo que muestra que todos los MPER-C Los bnAb dirigidos se unen a HIV-1 Env de manera similar. Tenga en cuenta que la superficie de interacción de lípidos de 4E10 es más hidrofóbica que la de los otros bnAbs26.

Los movimientos de inclinación y torsión del ectodominio del trímero del VIH-1 observados experimentalmente son consistentes con las simulaciones MD. Si bien se pueden anticipar movimientos para ectodominios de receptores de membrana, particularmente aquellos con segmentos TM de un solo paso, no conocemos hallazgos empíricos comparables informados en otros sistemas. Un estudio anterior de crio-EM de la proteína Env en entornos miméticos de membrana también observó la inclinación de Env unido a Fab, pero interpretó que la inclinación observada era principalmente el resultado de la unión de Fab21. Por el contrario, un estudio reciente de crio-ET de viriones nativos de VIH-1 publicado después de la finalización de este trabajo también encontró que las proteínas Env adoptan diferentes ángulos de inclinación en relación con la membrana del virus29, lo que corrobora de forma independiente nuestros resultados crio-EM y CGMD de una sola partícula que la proteína Env experimenta movimientos de inclinación en ausencia del anticuerpo unido. En este sentido, es concebible que la coordinación del acoplamiento ortogonal a gp120 por el receptor CD4 del VIH-1 y su co-receptor (CXCR4 o CCR5)30 que preparan e inician el cambio conformacional requerido para la fusión mediada por gp16031, respectivamente, plantee desafíos mitigado por la gesticulación del ectodominio.

Dicho esto, vale la pena enfatizar que durante las simulaciones MD, el trímero reside cerca de la membrana viral, ocluyendo el trípode, durante la mayor parte del análisis. Se utilizó menos del 10 % de las partículas individuales acumuladas para el mapa de resolución de 3,9 Å del trímero integrado en nanodisco sin unión de Fabs 4E10. Como era de esperar, los otros eran demasiado heterogéneos para permitir la visualización del trípode MPER, un hecho que subraya la idea de que el MPER es flexible en la membrana. Esta visión del MPER como sumergido en gran medida en la membrana también es consistente con la proximidad del ectodominio gp160 a la membrana que forma un espacio de rastreo de 10 Å observado aquí (Fig. 1) y en datos crio-ET independientes29. Estos dos hallazgos contrastan con los deducidos de otro estudio crio-ET de trímeros Env de BaL de VIH-1 en partículas virales inactivadas con aldritiol-2, en el que el MPER parece formar un enlace similar a un tallo entre el ectodominio Env y la membrana viral32. Actualmente se desconoce la base de esta disparidad.

Estudios previos de RMN en clados virales identificaron un par estructuralmente conservado de hélices N y C inmersas en lípidos virales separadas por una bisagra con uniones en tándem bloqueadas por residuos de cubierta de hélice necesarios identificados a partir del análisis de secuencia de más de 20,000 cepas virales de VIH-1. La ruptura de ambas articulaciones por sustitución de alanina de esos casquetes anuló tanto la hemifusión como la fusión mediada por cepas dependientes de CD4 así como independientes de CD413. Al cubrir simultáneamente la membrana viral con estos segmentos MPER hidrofóbicos móviles, se requiere menos deshidratación de la membrana viral para aproximarse físicamente a las bicapas lipídicas solvatadas para mediar la fusión, reduciendo así la barrera cinética alta requerida31,33. Además, el segmento MPER-TM per se induce la curvatura de la membrana y la movilidad de los lípidos, también involucrados en la hemifusión y fusión de la membrana33. Estas características facilitadoras de la fusión del MPER son dignas de mención, dado el menor número de picos por virión del VIH-1 en un orden de magnitud en comparación con muchos otros virus, incluido el influenza A34. Debido a que la unión de un solo Fab afecta los movimientos de la superficie de la membrana no solo del MPER unido sino también de los otros dos protómeros (Fig. 5d y Fig. 11 complementaria) y la unión de un anticuerpo o su fragmento Fab parece suficiente para inactivar el trimer35, esta alteración de la MPER probablemente contribuye de manera importante a la neutralización.

Teniendo en cuenta el papel vital del MPER en todas las etapas de la fusión del VIH-1, la razón fundamental del virus para proteger su estructura de trípode del ataque de los anticuerpos inmunitarios es evidente. Mientras que la inclinación del pico, y posiblemente el cebado de CD4, otorga acceso transitorio a un brazo Fab de anticuerpo, la inmunodominancia de otros sitios de ectodominio viral es una estrategia de desviación eficaz para mitigar la orientación de MPER35,36. Nuestros estudios previos de inmunogenicidad de MPER revelaron que, si bien un MPER de superficie de membrana era inmunogénico in vivo37, el ángulo de enfoque de la mayoría de los anticuerpos provocados por la vacuna es incompatible con el bloqueo estérico impuesto por el ectodominio. Una futura estrategia de vacuna es restringir los ángulos de enfoque de los anticuerpos a los adoptados por los bnAb existentes (Fig. 6b) para unir el MPER nativo durante la inclinación. La enorme diferencia entre la eficacia de la vacuna contra dos virus de ARN, a saber, el VIH-1 frente al CoV-2, está asociada con una alta tasa de mutaciones y la densidad de protección de glucanos del primero frente al segundo38. Dirigirse al sitio más conservado y accesible del VIH-1, por lo tanto, parece crítico para el desarrollo de vacunas protectoras contra el VIH-1, dada la justificación definida en este documento.

La IgG PG9 HRV3C se expresó en células FreestyleTM 293-F (Thermo Fisher Scientific) cultivadas en suspensión utilizando el medio de expresión FreeStyleTM 293. Se transfectó un cultivo de 1 L de células FreestyleTM 293-F con una mezcla 2:1 (p/p) de ADN de HC:LC PG9 usando PEI 'Max' (Polysciences, Inc). Después de 6 días, las células se sedimentaron y el sobrenadante se cargó en una columna de Proteína A-Sepharose. La IgG se eluyó con ácido acético 0,5 M, la solución se neutralizó con Tris-HCl 3 M, pH 9,0, y se dializó durante la noche frente a solución salina tamponada con fosfato (PBS; Na2HPO4 8 mM y KH2PO4 2 mM, pH 7,4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM).

La IgG 4E10 se expresó en células ExpiTM 293-F (Thermo Fisher Scientific) cultivadas en suspensión utilizando el medio de expresión ExpiTM 293. Se transfectó un cultivo de 1 litro de células ExpiTM 293-F con una mezcla 1:1 (p/p) de ADN HC:LC 4E10 utilizando PEI 'Max' (Polysciences, Inc). Después de 4 días, las células se sedimentaron y el sobrenadante se cargó en una columna de Proteína G-Sepharose. La IgG se eluyó usando ácido acético 500 mM, la solución se neutralizó con Tris-HCl 3 M, pH 9,0, y se dializó durante la noche frente a PBS. El 4E10 Fab se preparó reduciendo 4E10 IgG (15 mg/ml) en ditiotreitol 100 mM durante 1 hora a 37 °C, seguido de alquilación en yodoacetamida 2 mM durante 48 horas a 4 °C. A continuación, la IgG se digirió con endoproteinasa Lys-C (0,01 μg/μL; Roche Applied Sciences) en Tris-HCl 25 mM, pH 8,5 y EDTA 1 mM durante 4 ha 37 °C. La reacción de escisión se detuvo con Nα-p-tosil-1-lisina clorometilcetona (TLCK) 1 mM y leupeptina 0,4 mM, y los productos de escisión se pasaron por una columna de Proteína A-Sepharose para eliminar Fc e IgG intacta.

La secuencia de ADN que codifica los residuos 1–723 de la proteína Env de la cepa BG505 del VIH-1, que contiene tres mutaciones estabilizadoras (Ala501Cys, Thr605Cys, Ile559Pro), un sitio de glicosilación introducido (Thr332Asn) y un sitio de escisión de furina mejorado (REKR a RRRRRR), y el gen de la furina se clonaron individualmente en vectores de expresión pEG BacMam. Los plásmidos se transformaron en células de Escherichia coli DH10Bac para generar ADN bácmido. El baculovirus recombinante se produjo a través de tres rondas de amplificación viral en células Spodoptera frugiperda Sf9 cultivadas en medio Sf-900III SFM a 27 °C. Para la expresión de proteínas, los baculovirus que contenían ADN de gp145 y furina, respectivamente, se mezclaron en una proporción de 2:1 (v/v) y se usaron para infectar células FreestyleTM 293-F en una proporción de 1:10 (v/v). Después de 24 h de infección, se agregó butirato de sodio a los cultivos a una concentración final de 10 mM, los cultivos se movieron de 37 °C a 30 °C y se dejaron crecer durante 48 h adicionales. Las células se recogieron y se lavaron en PBS suplementado con EDTA 5 mM y albúmina de suero bovino al 0,1% (p/v) (Sigma Aldrich).

El trímero gp145 se purificó en base a protocolos publicados39 con ligeras modificaciones. Las células FreestyleTM 293-F que expresan gp145 se incubaron con PG9 IgG durante al menos 3 h, se lavaron con PBS y se solubilizaron con tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,5 % e inhibidor de proteasa cóctel (Roche). Después de la centrifugación del lisado celular a 38 400 × g durante 1 h a 4 °C, el sobrenadante se incubó durante la noche con resina de proteína A (GenScript) a 4 °C. La resina se lavó sucesivamente con 10 volúmenes de columna (CV) de tampón de lavado 1 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio 0,03 mg/ml, CHAPS al 0,1 % p/v), 10 CV de tampón de lavado 2 (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, desoxicolato de sodio 0,03 mg/ml, n-dodecil β-D-maltósido (DDM) al 0,1 % (p/v)) y 10 CV de tampón de lavado 3 ( Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio 0,03 mg/ml, DDM al 0,1 %, EDTA 2 mM). La PG9 IgG unida a la resina de Proteína A se digirió en Fabs con proteasa 3C en tampón de lavado 3 complementado con L-cisteína 80 mM (Sigma Aldrich) durante 4 ha 4 °C. El eluato se recogió, junto con un lavado de 5 CV con tampón SEC (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, desoxicolato de sodio 0,03 mg/ml, DDM al 0,05 %). La solución de proteína se concentró usando filtros centrífugos de corte Amicon Ultra de 15 ml y 100 kDa (Millipore Sigma) y se corrió sobre una columna de exclusión por tamaño Superose 6 (GE Healthcare) usando tampón SEC.

Los lípidos utilizados en este estudio son extracto de lípidos polares de cerebro, palmitoil oleil fosfatidilcolina (POPC) y palmitoil oleil fosfatidilglicerol (POPG), todos adquiridos de Avanti Polar Lipids. Los lípidos se solubilizaron con colato de sodio 20 mM en Tris-HCl 30 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM con sonicación y se mezclaron en una relación molar de 1,07:1,5:1. Para la reconstitución en nanodiscos, gp145 purificada en DDM, la proteína estructural MSP1D1dH5 y la solución de lípidos se mezclaron en una proporción molar de 1:20:300. Después de una incubación de 30 minutos en hielo, se agregaron Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) al 30 % del volumen de la muestra para eliminar los detergentes. Las Bio-Beads se reemplazaron después de 3 h. Después de que la mezcla se incubó durante la noche a 4 °C con rotación constante, las Bio-Beads se dejaron sedimentar por gravedad y se recogió el sobrenadante que contenía gp145 incrustado en nanodiscos.

Se incubó gp145 incrustada en nanodisco con 4E10 Fab en una relación molar de 1:100 durante al menos 3 h. Las muestras se concentraron utilizando filtros centrífugos Amicon Ultra de corte de 15 ml y 50 kDa (Millipore Sigma) y se cargaron en una columna de exclusión por tamaño Superose 6 equilibrada con HEPES 50 mM, pH 7,4 y NaCl 150 mM. Se agruparon las fracciones de pico que contenían gp145 incrustada en nanodisco decorada con 4E10 Fab.

Primero se evaluó la homogeneidad de las muestras mediante EM de tinción negativa utilizando formato de uranilo al 0,7 % (p/v) como se describe40. Para calcular los promedios de EM de tinción negativa, se recolectaron 100 imágenes para cada muestra utilizando una cámara de dispositivo acoplado por carga (AMT) XR16L-ActiveVu en un microscopio electrónico Philips CM10 (Philips) operado a un voltaje de aceleración de 100 kV. La ampliación calibrada fue de ×41 513 (ampliación nominal de ×52 000), lo que arroja un tamaño de píxel de 2,65 Å al nivel de la muestra. El desenfoque se fijó en –1,5 µm. Se seleccionaron manualmente aproximadamente 10 000 partículas para cada muestra utilizando el comando e2boxer.py del paquete de software EMAN241 y se dividieron en ventanas en imágenes de 180 × 180 píxeles. Después de la normalización de la imagen y el centrado de partículas, las imágenes de partículas se clasificaron en 100 grupos utilizando los procedimientos de clasificación de K-means implementados en SPIDER42.

El complejo gp145–4E10 Fab integrado en nanodisco se entrecruzó con BS3 en una proporción molar de 1:600 ​​durante 30 min en hielo. La reticulación se terminó añadiendo Tris 50 mM, pH 7,5. La muestra se dializó contra tampón con Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM para eliminar el agente de entrecruzamiento. La homogeneidad de la muestra se examinó mediante EM con tinción negativa. Para crio-EM, la concentración de la muestra se midió con un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific) y se ajustó a 0,2 mg/mL. Se aplicaron alícuotas de 4 μL a rejillas de óxido de grafeno (GO) descargadas con brillo suave (GO en Quantifoil R1.2/1.3, Cu, malla 400, Electron Microscopy Sciences) usando un Vitrobot Mark VI (Thermo Fisher Scientific) ajustado a 4 ° C y 100% de humedad. Después de 20 s, las rejillas se secaron durante 1 s con una fuerza de transferencia de -2 y se sumergieron en etano enfriado con nitrógeno líquido. Los conjuntos de datos Cryo-EM se recolectaron en un microscopio electrónico Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific) equipado con un detector de electrones K2 Summit (Gatan) con un aumento nominal de × 29,000 en modo de conteo de súper resolución. Después de agrupar 2 × 2 píxeles, el tamaño de píxel calibrado fue de 1,03 Å en el nivel de la muestra. Las exposiciones de 10 s se fraccionaron en dosis de 40 fotogramas (0,25 s por fotograma) con una tasa de dosis de 8 e–/píxel/s, lo que resultó en una dosis total de 80 e–/Å2. Los datos se recopilaron utilizando SerialEM43 en 'modo superrápido', en el que se exponen 3 × 3 orificios utilizando la inclinación del haz y el cambio de imagen antes de mover el escenario a la siguiente posición44. El rango de desenfoque se fijó de -1,5 a -2,5 μm. Los parámetros de recopilación de datos se resumen en la Tabla complementaria 1.

Las 30 404 pilas de películas de cinco sesiones de recopilación de datos se normalizaron en ganancia, se corrigieron por movimiento, se ponderaron por dosis y se agruparon en 2 × 2 píxeles en MotionCorr245. Los parámetros de la función de transferencia de contraste (CTF) se estimaron con CTFFIND4 (ref. 46) implementado en RELION-347. Las partículas se seleccionaron automáticamente sin plantillas con Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/), se extrajeron en imágenes individuales, se normalizaron y se sometieron a clasificación 2D en 100 clases en RELION-3. Se combinaron las clases con buenos promedios 2D, lo que produjo 3 039 896 partículas.

La identificación de partículas con Fabs 4E10 unidos se complicó por el predominio de la densidad del ectodominio gp145. Por lo tanto, solo se seleccionaron partículas de clases 2D que mostraban vistas laterales claras y se usaron para generar cuatro modelos iniciales usando el algoritmo ab initio en cryoSPARC v248. La reconstrucción ab initio generó un mapa que muestra la densidad clara de un ectodominio con tres Fab 4E10 enlazados, un mapa que muestra una fuerte densidad solo para el ectodominio y dos mapas "basura". Los primeros dos mapas y uno de los mapas basura se usaron como modelos iniciales para ejecutar dos rondas de refinamiento heterogéneo en cryoSPARC v2, lo que dio como resultado una pila de 362 646 partículas que mostraban una densidad clara para tres Fab 4E10 enlazados y 1 878 941 partículas que mostraban una densidad clara solo para el ectodominio.

Las 362 646 partículas que mostraban una densidad clara para tres Fab 4E10 unidos se sometieron a refinamientos homogéneos y no uniformes posteriores en cryoSPARC v249, lo que produjo un mapa final con una resolución global de 3,66 Å (Fig. 4a complementaria).

Las 1 878 941 partículas que mostraban una densidad clara solo para el ectodominio primero se sometieron a una clasificación supervisada en RELION-3, utilizando dos mapas de referencia generados con la herramienta Segger en Chimera a partir del mapa crio-EM del VIH-1 de longitud completa integrado en nanodisco. Proteína Env de la cepa AMC011 con PGT151 Fab y 10E8 Fab (EMDB 21332)21 unidos. Un mapa de referencia contenía solo la densidad del ectodominio y el nanodisco, mientras que el segundo mapa de referencia también incluía la densidad del 10E8 Fab. Las 224.730 partículas identificadas por esta clasificación que tienen unión Fab se sometieron a una clasificación 3D adicional. La densidad del PG9 Fab que se usó para la purificación siempre se ocultó. Después de una primera clasificación 3D en ocho clases, se combinaron cuatro clases que mostraban una clara densidad Fab y se sometieron a una segunda ronda de clasificación 3D en cuatro clases. Dos de las clases resultantes mostraron un ectodominio con un enlace Fab 4E10. Estas dos clases se combinaron y se sometieron a dos rondas más de clasificación 3D en cuatro clases. El mapa final que contenía 23 538 partículas se afinó mediante procesamiento posterior para producir un mapa de densidad con una resolución global de 8,8 Å (gp145•1Fab) (Fig. 4a complementaria). Una clase de la clasificación 3D inicial en cuatro clases mostró un ectodominio con dos Fab 4E10 unidos. Esta clase contenía 21 454 partículas y el mapa se afinó mediante procesamiento posterior para producir un mapa con una resolución global de 8,2 Å (gp145•2Fab) (Fig. 4a complementaria).

Las 1 654 211 partículas restantes de la clasificación supervisada inicial que no mostraban densidad para 4E10 Fab se sometieron a una clasificación supervisada adicional utilizando como referencias dos mapas de Env con y sin densidad de nanodisco. Las 1 153 408 partículas que mostraban densidad para el nanodisco se sometieron a cinco rondas de clasificación 3D; en cada paso de la clasificación, se seleccionaron las clases con densidad clara tanto para el ectodominio como para el nanodisco y se sometieron a una clasificación adicional. Finalmente, se combinaron y refinaron 47 616 partículas de dos clases que mostraban la mejor densidad en la región MPER, seguidas de refinamiento CTF y pulido bayesiano50. El mapa de densidad resultante se afinó mediante procesamiento posterior para obtener un mapa final con una resolución global de 3,9 Å (Fig. 4a complementaria).

La película que ilustra el rango de orientaciones que puede asumir el ectodominio en la superficie del nanodisco se generó a partir de mapas experimentales. Los mapas se seleccionaron de las rondas sucesivas de clasificación 3D de las 1.654.211 partículas que no mostraban densidad para 4E10 Fab. Los mapas fueron seleccionados en base a tener un número de partículas de 1000 partículas o menos (para identificar tantas orientaciones diferentes como sea posible) así como también en tener una densidad de nanodisco bien definida (para poder determinar la orientación del ectodominio con respecto a el nanodisco) (Fig. 3 complementaria). Estos criterios produjeron 20 mapas que se usaron para generar la película en Chimera51.

Solo para gp145, la estructura cristalina del ectodominio Env (residuos 31–662, PDB: 5I8H)52 y la estructura de RMN del segmento N del péptido MPER (residuos 663–671, PDB: 2PV6)14 se acoplaron manualmente en el gp145 mapa de densidad usando el comando "ajustar en el mapa" en Chimera. Después de fusionar las cadenas, el modelo se ajustó manualmente en Coot53 y se refinó contra la densidad usando phenix.real_space_refine54 con restricciones geométricas y Ramachandran mantenidas en todo momento. Después de eliminar las cadenas laterales en regiones de densidad pobremente definidas, el modelo final contiene información sobre la columna vertebral y la cadena lateral para los residuos 331–662 y solo el pliegue de la columna vertebral para los residuos 663–671.

Para el complejo gp145•3Fab, las estructuras cristalinas del ectodominio Env (residuos 31–662, PDB: 5I8H)52, la estructura de RMN del segmento N del péptido MPER (residuos 663–671, PDB: 2PV6)14 y del 4E10 Fab en complejo con el péptido MPER-C (residuos 672–684, PDB: 4XC3)26 se acoplaron manualmente en el mapa de densidad gp145•3Fab usando el comando "ajustar en el mapa" en Chimera. Después de fusionar las cadenas, el modelo se ajustó manualmente en Coot y se refinó contra la densidad usando phenix.real_space_refine con restricciones geométricas y Ramachandran mantenidas en todo momento. Después de eliminar las cadenas laterales en las regiones de densidad pobremente definidas, el modelo final contiene información de la columna vertebral y la cadena lateral para los residuos 31–662, y solo el pliegue de la columna vertebral para los residuos 663–684 (excepto para mantener las cadenas laterales para el residuo 678 en la cadena B y residuos 664, 671 y 674 en la cadena D.

Los modelos se refinaron contra la mitad del mapa 1, y luego se calcularon las curvas FSC entre el modelo refinado y la mitad del mapa 1 (trabajo), la mitad del mapa 2 (libre) y el mapa combinado (Figura complementaria 4c, e).

Para las simulaciones de gp145 sin ligando, se construyó un modelo vinculando la estructura crio-EM del ectodominio (este estudio) a la estructura de RMN del dominio transmembrana MPER, incluidos los primeros siete residuos del dominio citoplasmático (PDB: 6DLN). La proteína se colocó en una bicapa lipídica que constaba de POPC y colesterol en una proporción molar de 4:1, y el sistema se solvató en NaCl 150 mM usando el script insane.py55.

Se establecieron simulaciones de grano grueso utilizando Martinize2 (https://github.com/marrink-lab/vermouth-martinize) y el último modelo de campo de fuerza MARTINI356. La estructura cuaternaria y terciaria se retuvo aplicando una red elástica al modelo CG, con una fuerza constante de 500 kJ mol-1 nm-2, y distancias de corte superior e inferior de 0,9 nm y 0,5 nm, respectivamente57. Todas las simulaciones se realizaron con GROMACS 2020.6 (refs. 58, 59) y se utilizó el algoritmo de salto de rana60 para integrar las ecuaciones de movimiento newtonianas con un paso de tiempo de 20 fs. Las simulaciones se realizaron utilizando el esquema de corte de Verlet para la búsqueda de vecinos, actualizado cada 20 pasos61. Las interacciones electrostáticas se calcularon utilizando Reaction-Field, con una distancia de corte de Coulomb de 1,1 nm62. El termostato de cambio de escala de velocidad se usó para mantener la temperatura en 310 K63. El acoplamiento de presión para las simulaciones de equilibrio y producción se realizó con el barostato Berendsen64 y Parrinello-Rahman65, respectivamente. Se realizaron cinco simulaciones, a partir de semillas aleatorias únicas, con fases de equilibrio de 4,75 ns y ciclos de producción de 10 μs cada una.

Para las simulaciones de gp145 en complejo con 4E10 Fab, se tomó una instantánea de una simulación de gp145 sin ligando que mostró una conformación MPER-C similar a la del modelo crio-EM de la gp145 unida a Fab 4E10. Esta instantánea de granularidad gruesa se convirtió en una vista de todos los átomos utilizando el script retrospectivo.py66 y el convertidor CHARMM-GUI All-atom67. El modelo atomístico resultante se usó para acoplar la estructura del Fab 4E10 (PDB: 4XC3), guiado por el péptido MPER-C unido a Fab, con ajustes menores para evitar choques estéricos con el ectodominio gp145. La proteína se colocó en una bicapa lipídica que constaba de POPC y colesterol en una proporción molar de 4:1, y el sistema se solvató en NaCl 150 mM utilizando el script insane.py.

Se configuraron y ejecutaron simulaciones de grano grueso como se describe para gp145 sin ligando. Se aplicó una red elástica con los mismos parámetros descritos anteriormente. También se aplicaron interacciones de redes elásticas entre el 4E10 Fab y el segmento MPER-C para mantener las interacciones de unión. Se realizaron cinco simulaciones, a partir de semillas aleatorias únicas, con fases de equilibrio de 6,75 ns y ciclos de producción de 1 μs cada una.

Las trayectorias de simulación se centraron utilizando gmx trjconv. gmx gangle se utilizó para medir los ángulos del ectodominio gp145 y los segmentos MPER-C. Las trayectorias se visualizaron usando VMD v.1.9.4a12 (ref. 68) y los gráficos se realizaron usando Microsoft Excel.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan este estudio están disponibles de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Los mapas crio-EM se han depositado en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los códigos de acceso EMD-25022 (gp145), EMD-25024 (gp145•1Fab), EMD-25025 (gp145•2Fab) y EMD-25045 ( gp145•3Fab). Las coordenadas atómicas se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) con los códigos de acceso 7SC5 (gp145) y PDB-7SD3 (gp145•3Fab). Los códigos de acceso de PDB informados anteriormente utilizados son los siguientes: 1TZG (4E10 Fab/MPER), 2PV6 (segmento N del péptido MPER, NMR); 4U6G (10E8 Fab/MPER); 4XC3 (péptido 4E10 Fab/MPER-C); 5I8H (ectodominio Env); 5U3N (DH511 Fab/MPER); 6DLN (trípode MPER); 6E8W (MPER tallo–burbuja); 6O3J (PGZL1 Fab/MPER). Los códigos de acceso de EMDB informados anteriormente utilizados son los siguientes: EMDB-21332 (AMC011 con PGT151 Fab y 10E8 Fab unidos) y EMDB-21334 (AMC011 con 10E8 Fab unidos).

Mann, JM AIDS in the World (Harvard University Press, 1992).

Sharp, PM & Hahn, BH La evolución del VIH-1 y el origen del SIDA. Filosofía Trans. R. Soc. largo B. Biol. ciencia 365, 2487–2494 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Actualización mundial sobre el sida de ONUSIDA de 2021 — Enfrentando las desigualdades — Lecciones para las respuestas a la pandemia de 40 años de sida. https://www.unaids.org/en/resources/documents/2021/2021-global-aids-update (2021).

Kwong, PD & Mascola, JR Vacunas contra el VIH-1 basadas en la identificación de anticuerpos, la ontogenia de las células B y la estructura del epítopo. Inmunidad 48, 855–871 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mascola, JR & Haynes, BF Anticuerpos neutralizantes del VIH-1: comprensión de los caminos de la naturaleza. inmunol. Rev. 254, 225–244 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Sok, D. & Burton, DR Avances recientes en la neutralización general de anticuerpos contra el VIH. Nat. inmunol. 19, 1179–1188 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haynes, BF, Burton, DR & Mascola, JR Múltiples roles para los anticuerpos ampliamente neutralizantes del VIH. ciencia Traducir Medicina. 11, eaaz2686 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Starcich, BR et al. Identificación y caracterización de regiones conservadas y variables en el gen de la envoltura de HTLV-III/LAV, el retrovirus del SIDA. Celda 45, 637–648 (1986).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Berndsen, ZT et al. Visualización del escudo de glucano de HIV-1 Env a través de escalas. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 117, 28014–28025 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wei, X. et al. Neutralización de anticuerpos y escape por el VIH-1. Naturaleza 422, 307–312 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kwong, PD et al. El VIH-1 evade la neutralización mediada por anticuerpos a través del enmascaramiento conformacional de los sitios de unión al receptor. Naturaleza 420, 678–682 (2002).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Bonsignori, M. et al. Vía de maduración desde la línea germinal hasta un amplio neutralizador de VIH-1 de un anticuerpo imitador de CD4. Celda 165, 449–463 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, Z.-YJ et al. La interrupción de los residuos 671 y 674 que tapan la hélice revela un papel en la entrada del VIH-1 para un segmento de bisagra especializado de la región externa proximal de la membrana de gp41. J. Mol. Biol. 426, 1095–1108 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sun, Z.-YJ et al. El anticuerpo ampliamente neutralizante del VIH-1 extrae su epítopo de una región del ectodominio gp41 retorcida en la membrana viral. Inmunidad 28, 52–63 (2008).

Artículo PubMed Google Académico

Canción, L. et al. Los anticuerpos anti-VIH-1 ampliamente neutralizantes interrumpen una función relacionada con bisagras de gp41 en la interfaz de la membrana. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 106, 9057–9062 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, P., Winkler, H., Chertova, E., Taylor, KA & Roux, KH Tomografía crioelectrónica de picos de envoltura de VIH-1: evidencia adicional de patas tipo trípode. Patog de PLoS. 4, e1000203 (2008).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zanetti, G., Briggs, JAG, Grünewald, K., Sattentau, QJ y Fuller, SD Estructura tomográfica crioelectrónica de un complejo de envoltura de virus de inmunodeficiencia in situ. Patog de PLoS. 2, e83 (2006).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Blanco, TA et al. Arquitecturas moleculares de glicoproteínas triméricas SIV y HIV-1 en virus intactos: variación dependiente de la cepa en la estructura cuaternaria. Patog de PLoS. 6, e1001249 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Julien, J.-P. et al. Estructura cristalina de un trímero de envoltura de VIH-1 escindido soluble. Ciencia 342, 1477–1483 (2013).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Brugger, B. et al. El lipidoma del VIH: una balsa con una composición inusual. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 103, 2641–2646 (2006).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rantalainen, K. et al. Envoltura de VIH-1 y estructuras de anticuerpos MPER en ensamblajes de lípidos. Informe celular 31, 107583 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fu, Q. et al. Estructura de la región externa proximal de la membrana de la glicoproteína de la envoltura del VIH-1. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 115, E8892–E8899 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kwon, B., Lee, M., Waring, AJ y Hong, M. Estructura oligomérica y pliegue tridimensional de la región externa próxima a la membrana gp41 del VIH y el dominio transmembrana en bicapas de fosfolípidos. Mermelada. química Soc. 140, 8246–8259 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. Análisis topológico de gp41 MPER en bicapas lipídicas relevantes para el estado de prefusión de la envoltura metaestable del VIH-1. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 116, 22556–22566 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cardoso, RMF et al. El anticuerpo anti-VIH ampliamente neutralizante 4E10 reconoce una conformación helicoidal de un motivo asociado a la fusión altamente conservado en gp41. Inmunidad 22, 163–173 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Irimia, A., Sarkar, A., Stanfield, RL y Wilson, IA Identificación cristalográfica de lípidos como componente integral del epítopo del anticuerpo ampliamente neutralizante 4E10 del VIH. Inmunidad 44, 21–31 (2016).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Irimia, A. et al. Interacciones de lípidos y ángulo de enfoque de la membrana viral del VIH-1 del anticuerpo ampliamente neutralizante 10E8: conocimientos para el diseño de vacunas y tratamientos. Patog de PLoS. 13, e1006212 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Jefferson, RE, Min, D., Corin, K., Wang, JY y Bowie, JU Aplicaciones de métodos de molécula única a estudios de plegamiento de proteínas de membrana. J. Mol. Biol. 430, 424–437 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mangala Prasad, V. et al. Cryo-ET de Env en viriones de VIH intactos revela variación estructural y posicionamiento en la red de Gag. Celda 185, 641–653.e17 (2022).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaik, MM et al. Base estructural del reconocimiento del correceptor por el pico de la envoltura del VIH-1. Naturaleza 565, 318–323 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Harrison, SC Fusión de membrana viral. Virología 479–480, 498–507 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

Li, Z. et al. Estructuras subnanométricas de trímeros de envoltura de VIH-1 en partículas de virus inactivadas con aldritiol-2. Nat. Estructura. mol. Biol. 27, 726–734 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sutherland, M., Kwon, B. & Hong, M. Interacciones de la región externa próxima a la membrana de gp41 del VIH y el dominio transmembrana con membranas de fosfolípidos de 31P NMR. bioquimica Biografía. Acta BBA - Biomembr. 1863, 183723 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Zhu, P. et al. Distribución y estructura tridimensional de los picos de la envoltura del virus del SIDA. Naturaleza 441, 847–852 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang, X., Kurteva, S., Lee, S. & Sodroski, J. Estequiometría de la neutralización de anticuerpos del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1. J. Virol. https://doi.org/10.1128/JVI.79.6.3500-3508.2005 (2005).

Nelson, JD et al. Un anticuerpo neutralizante de afinidad mejorada contra la región externa próxima a la membrana del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 gp41 reconoce un epítopo entre los de 2F5 y 4E10. J.Virol. 81, 4033–4043 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, M. et al. La inmunogenicidad de los segmentos de la región externa próxima a la membrana (MPER) del VIH-1 gp41 unidos a la membrana está dominada por la accesibilidad de los residuos y modulada por la estereoquímica. J. Biol. química 288, 31888–31901 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fischer, W. et al. VIH-1 y SARS-CoV-2: patrones en la evolución de dos patógenos pandémicos. Microbio huésped celular 29, 1093–1110 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JH, Ozorowski, G. & Ward, AB Estructura Cryo-EM de un trímero de envoltura de VIH-1 escindido, completamente glicosilado y nativo. Ciencia 351, 1043–1048 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y. & Walz, T. Tinción negativa y clasificación de imágenes: herramientas poderosas en microscopía electrónica moderna. Biol. Proceder En línea 6, 23–34 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang, G. et al. EMAN2: una suite extensible de procesamiento de imágenes para microscopía electrónica. J. Estructura. Biol. 157, 38–46 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Frank, J. et al. SPIDER y WEB: procesamiento y visualización de imágenes en microscopía electrónica 3D y campos afines. J. Estructura. Biol. 116, 190–199 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mastronarde, DN Tomografía de microscopio electrónico automatizado usando predicción robusta de movimientos de especímenes. J. Estructura. Biol. 152, 36–51 (2005).

Artículo PubMed Google Académico

Cheng, A. et al. Microscopía crioelectrónica de partícula única de alta resolución mediante desplazamiento de imagen de haz. J. Estructura. Biol. 204, 270–275 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. eLife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ y Brubaker, MA cryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida de estructuras crio-EM sin supervisión. Nat. Métodos 14, 290–296 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Punjani, A., Zhang, H. & Fleet, DJ Refinamiento no uniforme: la regularización adaptativa mejora la reconstrucción crio-EM de una sola partícula. Nat. Métodos 17, 1214–1221 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zivanov, J., Nakane, T. & Scheres, SHW Un enfoque bayesiano para la corrección del movimiento inducido por haz en el análisis de partículas individuales crio-EM. IUCrJ 6, 5–17 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kong, R. et al. Péptido de fusión del VIH-1 como sitio de vulnerabilidad al anticuerpo neutralizante. Ciencia 352, 828–833 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Adams, PD et al. PHENIX: un sistema integral basado en Python para la solución de estructuras macromoleculares. Acta Crystallogr. D. Biol. cristalogr. 66, 213–221 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wassenaar, TA, Ingólfsson, HI, Böckmann, RA, Tieleman, DP & Marrink, SJ Lipidómica computacional con locura: una herramienta versátil para generar membranas personalizadas para simulaciones moleculares. J. Chem. Cálculo de la teoría. 11, 2144–2155 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Souza, PCT et al. Martini 3: un campo de fuerza de propósito general para la dinámica molecular de grano grueso. Nat. Métodos 18, 382–388 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Periole, X., Cavalli, M., Marrink, S.-J. & Ceruso, MA Combinación de una red elástica con un campo de fuerza molecular de grano grueso: estructura, dinámica y reconocimiento intermolecular. J. Chem. Cálculo de la teoría. 5, 2531–2543 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Van Der Spoel, D. et al. GROMACS: rápido, flexible y gratuito. J. Cómputo. química 26, 1701–1718 (2005).

Artículo Google Académico

Abraham, MJ et al. GROMACS: simulaciones moleculares de alto rendimiento mediante paralelismo multinivel desde portátiles hasta superordenadores. SoftwareX 1–2, 19–25 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Hockney, RW, Goel, SP & Eastwood, JW Modelos informáticos silenciosos de alta resolución de un plasma. J. Cómputo. física 14, 148–158 (1974).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Verlet, L. 'Experimentos' informáticos sobre fluidos clásicos. I. Propiedades termodinámicas de las moléculas de Lennard-Jones. física Rev. 159, 98–103 (1967).

Artículo ADS CAS Google Académico

Tironi, IG, Sperb, R., Smith, PE y van Gunsteren, WF Un método de campo de reacción generalizado para simulaciones de dinámica molecular. J. Chem. física 102, 5451–5459 (1995).

Artículo ADS CAS Google Académico

Bussi, G., Donadio, D. & Parrinello, M. Muestreo canónico mediante reescalado de velocidad. J. Chem. física 126, 014101 (2007).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Berendsen, HJC, Postma, JPM, van Gunsteren, WF, DiNola, A. & Haak, JR Dinámica molecular con acoplamiento a un baño externo. J. Chem. física 81, 3684–3690 (1984).

Artículo ADS CAS Google Académico

Parrinello, M. & Rahman, A. Transiciones polimórficas en monocristales: un nuevo método de dinámica molecular. Aplicación J. física 52, 7182–7190 (1981).

Artículo ADS CAS Google Académico

Wassenaar, TA, Pluhackova, K., Böckmann, RA, Marrink, SJ & Tieleman, DP Retrocediendo: un enfoque geométrico flexible para la transformación inversa de modelos de grano grueso a modelos atomísticos. J. Chem. Cálculo de la teoría. 10, 676–690 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jo, S., Kim, T., Iyer, VG & Im, W. CHARMM-GUI: una interfaz gráfica de usuario basada en web para CHARMM. J. Cómputo. química 29, 1859–1865 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Humphrey, W., Dalke, A. & Schulten, K. VMD: dinámica molecular visual. J. Mol. Grafico. 14, 33–38 (1996).

Artículo CAS PubMed Google Académico

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Agradecemos a M. Ebrahim, J. Sotiris y H. Ng del Evelyn Gruss Lipper Cryo-EM Resource Center de la Universidad Rockefeller por su ayuda con la recopilación de datos crio-EM. Agradecemos al Dr. P. Cesar Telles de Souza por proporcionarnos un archivo de topología beta MARTINI3 para colesterol. Este trabajo fue apoyado por la subvención P01 AI126901 de los Institutos Nacionales de Salud (ELR, TW).

Estos autores contribuyeron por igual: Shuang Yang, Giorgos Hiotis.

Laboratorio de Microscopía Electrónica Molecular, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Shuang Yang, George Hiotis y Thomas Walz

Programa Tri-Institucional de Doctorado en Biología Química, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Giorgos Hiotis

Laboratorio de Inmunobiología, Departamento de Oncología Médica, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Yi Wang, Junjian Chen, Jia-huai Wang, Mikyung Kim y Ellis L. Reinherz

Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Yi Wang, Junjian Chen y Ellis L. Reinherz

Departamento de Química Biológica y Farmacología Molecular, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Jia Huai Wang

Departamento de Biología del Cáncer, Instituto del Cáncer Dana-Farber, Boston, MA, EE. UU.

Jia Huai Wang

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Jia Huai Wang

Departamento de Dermatología, Facultad de Medicina de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

mikyung kim

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ELR y TW concibieron el estudio. SY, GH, MK, ELR y TW diseñaron los experimentos. SY, YW y JC prepararon anticuerpos Fab. SY realizó todos los experimentos de bioquímica y biología estructural. GH realizó todos los experimentos de dinámica molecular. Experimentos supervisados ​​por JHW, MK, ELR y TW. Todos los autores analizaron los resultados. SY, ELR y TW escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Ellis L. Reinherz o Thomas Walz.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Tyler Reddy y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yang, S., Hiotis, G., Wang, Y. et al. El movimiento dinámico de la espiga del VIH-1 crea la vulnerabilidad de su trípode unido a la membrana frente al ataque de los anticuerpos. Nat Comun 13, 6393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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Recibido: 09 mayo 2022

Aceptado: 06 de octubre de 2022

Publicado: 27 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34008-y

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