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Aug 04, 2023

SARS

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1170 (2022) Citar este artículo

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La glicoproteína del pico trimérico (S), que sobresale de la envoltura viral del SARS-CoV-2, se une a la ACE2 humana, iniciada por al menos un dominio de unión al receptor (RBD) de un protómero que cambia de "abajo" (cerrado) a "arriba". Estado (abierto). Aquí, utilizamos simulaciones de dinámica molecular a gran escala y cálculos de muestreo de paraguas de intercambio de réplicas bidimensionales con más de mil ventanas y un total agregado de 160 μs de simulación para investigar esta transición con y sin glicanos. Encontramos que el pico glicosilado tiene una mayor barrera para la apertura y también favorece energéticamente el estado deprimido sobre el estado de arriba. El análisis de la ruta de apertura de la proteína S revela que los glucanos en N165 y N122 interfieren con los enlaces de hidrógeno entre el RBD y el dominio N-terminal en el estado activo, mientras que los glucanos en N165 y N343 pueden estabilizar los estados inactivo y activo. Finalmente, estimamos cómo cambia la exposición del epítopo para varios anticuerpos conocidos a lo largo del camino de apertura. Encontramos que el epítopo del anticuerpo BD-368-2 está continuamente expuesto, lo que explica su alta eficacia.

La pandemia de COVID-19 causada por el coronavirus SARS-CoV-2 se propagó rápidamente en todo el mundo con un impacto perjudicial sin precedentes en la salud y las economías mundiales1. El rápido desarrollo de varias vacunas2, tratamientos con anticuerpos monoclonales3 y terapias4 han mitigado el brote viral actual. Sin embargo, la amenaza constante de variantes, incluidos los sublinajes de Omicron ahora dominantes5, y la posibilidad de futuros brotes de coronavirus6 requieren una comprensión profunda del ciclo de vida viral, incluido el reconocimiento, la unión, la infección y la respuesta inmunitaria.

La infección por SARS-CoV-2 se inicia con el reconocimiento y la unión al receptor de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) de la célula huésped7,8. Este proceso está mediado por la proteína de punta (S) del SARS-CoV-2, una glicoproteína de fusión homotrimérica de clase I que sobresale de la superficie del virión del SARS-CoV-2. El lanzamiento de la secuencia de la proteína S a principios de 2020, combinado con el trabajo estructural anterior en los betacoronavirus relacionados, condujo a la rápida determinación de estructuras de construcciones de ectodominio de proteína S solubilizadas y estabilizadas antes de la fusión9,10,11, así como picos de longitud completa12 y viriones intactos13. Cada protómero consta de las subunidades S1 y S2 separadas por un sitio de escisión de furina multibásica. S1 contiene el dominio de unión al receptor (RBD) y media el reconocimiento de la célula huésped, mientras que S2 consiste en la maquinaria de fusión de membrana necesaria para la entrada viral7. La proteína S es un objetivo antigénico principal con múltiples epítopos que son el objetivo del sistema inmunitario humano, incluido el RBD y el dominio N-terminal (NTD)14,15,16,17. También se sugiere que el RBD recombinante es un posible inhibidor de la entrada contra el SARS-CoV-218. Además, la glicosilación de la proteína S ayuda a enmascarar y proteger al virus de la respuesta del sistema inmunitario del huésped19,20,21. La proteína S se caracteriza por estados conformacionales ascendentes y descendentes, que se interconvierten transitoriamente a través de un movimiento similar a una bisagra que expone el motivo de unión al receptor (RBM), que está compuesto por los residuos RBD S438 a Q50622. El RBM está enterrado en la interfase entre protómeros de la proteína down S; por lo tanto, la vinculación a ACE2 se basa en la interconversión estocástica entre los estados hacia abajo y hacia arriba.

Los estudios de microscopía crioelectrónica (crio-EM) han revelado información estructural detallada para los estados conformacionales ascendentes y descendentes23. Sin embargo, relativamente pocos estudios han explorado la dinámica de estos estados arriba/abajo y la interconversión entre ellos. Por ejemplo, se ha utilizado FRET de una sola molécula para demostrar la naturaleza estocástica de las transiciones de proteína S24, con escalas de tiempo informadas del orden de milisegundos a segundos. Es de destacar que los estudios posteriores de FRET de una sola molécula encuentran una cinética de transición hacia abajo alterada para las proteínas de pico mutantes25. Las simulaciones de dinámica molecular (MD) complementan estos estudios experimentales al proporcionar las descripciones a nivel atómico de los estados intermedios entre abajo y arriba que son necesarios para caracterizar la dinámica de apertura de la proteína S. Las simulaciones de MD han revelado información detallada sobre la estabilidad estructural y el papel de la glicosilación tanto para los estados inactivos como inactivos, así como para las interacciones entre residuos y los detalles de la unión a ACE220,21,26,27,28,29. Se han informado vías de apertura determinadas usando MD dirigida y MD dirigida29,30,31. Además, las simulaciones exhaustivas que utilizan técnicas de muestreo mejoradas como el conjunto ponderado32 y el muestreo adaptativo de amplificación de fluctuación de rasgos específicos (FAST) combinado con Folding@home33 han proporcionado detalles de múltiples vías para la apertura de la proteína S. Además, las características del panorama energético de estas transiciones conformacionales que son necesarias para la unión y entrada viral están comenzando a emerger27,30,31,34, incluida la combinación de datos crio-EM con simulaciones MD para revelar múltiples subpoblaciones tanto para el estados arriba y abajo35,36.

Un estudio reciente realizado por Amaro y colaboradores ha resaltado el papel funcional de los glucanos en N165 y N234 más allá del blindaje26 basado en simulaciones de equilibrio separadas de los estados hacia arriba y hacia abajo de la proteína S. Cuando el RBD pasa al estado ascendente, el glicano en N234 gira hacia el vacío resultante, estabilizando la conformación ascendente. Además, las simulaciones de MD y la mutagénesis han revelado contribuciones del glucano en N343 a la dinámica de la apertura de RBD y la unión de ACE232. Estos resultados sugirieron un papel para el glicano en N343 en la transición conformacional de apertura a través de "elevación" del RBD a través de interacciones secuenciales con múltiples residuos de RBD, lo que se conoce como "activación de glicano".

Aquí, describimos paisajes bidimensionales (2D) de energía libre recién determinados de las transiciones de apertura y cierre de la proteína S del SARS-CoV-2 utilizando simulaciones de muestreo paraguas de intercambio de réplicas (REUS) ejecutadas en la supercomputadora de preexaescala Summit en Oak Ridge National Lab (ORNL) para proteína S glicosilada y no glicosilada. Destacamos el impacto de los glicanos en cada estado y en la cinética de apertura de picos. Además, analizamos la exposición de epítopos prominentes en la superficie de la proteína S y proporcionamos una imagen dinámica de la unión de anticuerpos a lo largo de la ruta de apertura de picos. Finalmente, informamos los resultados de las simulaciones MD de equilibrio de los sistemas glicosilados y no glicosilados para los estados conformacionales tanto hacia abajo como hacia arriba para caracterizar aún más el papel estabilizador de los glicanos.

Usando simulaciones REUS, estudiamos el cambio de energía libre desde el estado bajo del pico hasta el estado alto cuando está completamente glicosilado, así como cuando no está glicosilado. Modelamos el estado activo de tipo salvaje (WT) en función de la estructura mutante de diprolina de Walls et al.10 (PDB: 6VYB). El estado inactivo se modeló usando una estructura más reciente de Cai et al.12 (PDB: 6XR8) sin las mutaciones de diprolina. El glicano con la población más alta en los datos de espectroscopia de masas de Crispin y colaboradores19 en cada sitio se agregó utilizando el servidor web GLYCAM desarrollado por el grupo Woods (http://glycam.org)37,38. Estos modelos se ilustran en la Fig. 1a, b con detalles adicionales de los sistemas proporcionados en Métodos.

a La proteína S trimérica en estado completo, coloreada por el protómero. Los glicanos se muestran como esferas rojas. b Vista superior de la proteína S en el estado superior. Se destacan los dominios importantes de la espiga, incluido el dominio N-terminal (NTD, 14–306), los dominios de unión al receptor (RBD, 336–518), la heptada repetida 1 (HR1, 908–986) y la hélice central (CH, 987-1035). c, d Las dos variables colectivas definidas para describir la apertura de RBD-A incluyen: c la distancia del centro de masa d entre RBD-A (336–518, rosa) y SD1-B (531–592, cal), y d el ángulo diedro ϕ formado por el centro de masa de los dominios RBD-A (336–518, rosa), SD1-A (531–592, violeta), SD2-A (593–677, azul hielo) y NTD-A (27–307, cian). Se muestran RBD-A en los estados abajo (rosa sólido) y arriba (rosa transparente).

Primero ejecutamos simulaciones metadinámicas de las estructuras crio-EM en los estados alto y bajo, lo que les permitió explorar el espacio conformacional a su alrededor y conectar las dos estructuras. El espacio conformacional se describe mediante dos variables colectivas, que son (1) la distancia del centro de masa (d) entre la apertura RBD-A y una parte estacionaria de la espiga que actúa como punto de pivote, a saber, el subdominio vecino 2 en cadena B (SD2-B), y (2) el ángulo diedro (ϕ) formado por los centros de masa de la apertura RBD-A y otros dominios estacionarios en el mismo protómero, a saber, SD2-A, SD1-A y NTD- A (Fig. 1c, d). Se verificó que los dominios estacionarios tenían una dinámica mínima en comparación con el rango de movimiento de RBD-A (Tabla S1). Luego se extrajeron instantáneas de las simulaciones metadinámicas para generar las simulaciones REUS, que se ejecutaron a lo largo de las mismas dos variables colectivas. Para el sistema glicosilado, realizamos un recocido simulado en los glicanos para aleatorizar sus conformaciones en cada ventana. Se ejecutó una serie de simulaciones REUS para explorar más a fondo las diferentes regiones del espacio d-ϕ, usando hasta 1049 y 1211 ventanas (Tabla S2), y un tiempo de simulación total de 65 μs y 91 μs para los sistemas glicosilados y no glicosilados , respectivamente.

Para el sistema glicosilado, las conformaciones de las dos estructuras crio-EM surgieron como mínimos de energía en el potencial 2D de la fuerza media (PMF) como se esperaba (Fig. 2a). Entre las dos conformaciones estables, el estado superior posee una energía mayor que el estado inferior en 5,2 ± 0,1 kcal/mol (Figs. 2c, S1a). Este hallazgo es consistente con múltiples estudios computacionales que utilizan varios métodos de muestreo mejorados, que también concluyeron que el estado hacia abajo es la conformación más probable33,34,39,40. Las diferencias entre los dos pozos de energía de estado final no terminan en su profundidad sino también en su amplitud. Si medimos el ancho de los pozos de energía a lo largo de d a 2,5 kcal/mol por encima de su mínimo de energía, el pozo de energía del estado inferior se extiende desde d = 43,1 Å a 48,9 Å, mientras que el pozo de energía del estado superior cubre d = 60,1 Å a 75,6 Å, lo que hace que este último sea 2,7 veces más ancho que el primero. Trabajos recientes de Zimmerman et al.33 y Sztain et al.32 también encuentran que el RBD es muy flexible en el estado superior, lo que permite una amplia gama de estructuras en el estado superior que se abren más que la estructura crio-EM. Nuestro PMF ahora permite estimar la probabilidad de observar estructuras tan abiertas. También calculamos la ruta de energía mínima (MEP) 41,42 que conecta los estados hacia abajo y hacia arriba (Fig. 2a, Película complementaria 1). La trayectoria es principalmente diagonal en el PMF 2D, con la excepción de un fuerte aumento de ϕ al salir del pozo de energía del estado inferior y una ligera disminución de ϕ al ingresar al pozo de energía del estado superior. La barrera de energía que separa las dos conformaciones estables tiene una altura de 11,0 ± 0,1 kcal/mol y está ubicada en d = 55,6 Å.

a, b Los PMF 2D de los sistemas a glicosilados y b no glicosilados a lo largo de dos variables colectivas, d y ϕ, definidas para describir la apertura de RBD-A (Fig. 1c, d). La ubicación de las estructuras crio-EM de estado inferior (6XR8) y superior (6VYB) se indica con un signo "+" y "x", respectivamente. La línea punteada negra muestra el MEP para cada sistema. c Las energías libres se proyectan sobre d y se trazan como PMF 1D. Ver también Datos complementarios 1.

El PMF para el sistema no glicosilado es cualitativamente similar pero significativamente diferente cuantitativamente del glicosilado (Fig. 2b). Sin los glicanos, la diferencia de energía entre los estados hacia abajo y hacia arriba se vuelve sorprendentemente pequeña y cae por debajo del error estadístico (Figs. 2c, S1b). La relación de ancho a lo largo de d entre los pozos de energía de estado bajo y alto permanece en 2,7, igual que el sistema glicosilado, con el pozo de estado bajo que se extiende desde d = 43,6 Å a 49,1 Å y el pozo de estado alto desde d = 59,0 Å a 74,1 Å. El pozo de energía mucho más amplio en el estado superior da como resultado una población de equilibrio dominante del 88% sobre la población del estado inferior del 12%, a pesar de la pequeña diferencia de energía entre ellos. Tanto la posición del mínimo de energía del estado superior como la barrera de energía se desplazan hacia el estado inferior, pasando de d = 70,6 Å a 67,6 Å y de d = 55,6 Å a 52,6 Å, respectivamente. También observamos que la altura de la barrera de energía entre las dos conformaciones estables se reduce a 5,1 ± 0,1 kcal/mol. Combinando la información anterior, nuestros resultados indican que la eliminación de glicanos no solo cambia la proporción de población del estado hacia abajo, sino que también afecta la extensión de la apertura del RBD en el mínimo del estado, ambos posiblemente perjudiciales para la funcionalidad de la S proteína. Los experimentos también han demostrado que eliminar los glucanos alrededor del RBD (N234, N165 y N343)26,32 o disminuir la complejidad de los glucanos43 conduce a una disminución en la unión de ACE2.

Para cuantificar la cinética de la apertura de la proteína S, calculamos el tiempo medio del primer paso (MFPT) a lo largo del MEP utilizando la ecuación de difusión de Smoluchowski para el sistema glicosilado (consulte la Nota complementaria 1) 44,45. La ecuación de difusión de Smoluchowski proporciona una descripción simple de una "partícula" browniana, basándose únicamente en el coeficiente de difusión y la energía libre a lo largo del MEP. Se realizaron simulaciones restringidas adicionales para determinar el coeficiente de difusión a lo largo del MEP utilizando la función de autocorrelación de velocidad (VACF)46,47. El MFPT desde el estado inactivo hasta el estado activo es de 1478,5 ms, mientras que el inverso es de 0,9 ms. En comparación con la observación experimental por FRET24 de una sola molécula, parece que el MFPT de abajo hacia arriba está sobreestimado en ~ 5 × y que para la dirección inversa está subestimado en ~ 100 ×, posiblemente debido al hecho de que no tomamos en cuenta para la larga escala de tiempo para que los glucanos se equilibren al calcular el coeficiente de difusión. También aproximamos el MFPT para el sistema no glicosilado. La barrera de transición reducida en el PMF (Fig. 2c) condujo a una reducción concomitante en el MFPT, que es de 143 μs para la transición de abajo hacia arriba y 497 μs para la transición de arriba hacia abajo.

A continuación, consideramos la dinámica química de acuerdo con las siguientes reacciones pareadas:

en el que D representa el estado inactivo de la proteína S, U el estado activo y U:ACE2 el estado unido (Fig. 3a). Las tasas de apertura/cierre (kopen/kclose) están determinadas por los MFPT y las tasas de vinculación/desvinculación (kon/koff) para RBD solo a ACE2 se toman de Lan et al.22. Después de resolver la ecuación maestra para estas reacciones ([ACE2]i = 15 nM; consulte la Nota complementaria 1), encontramos que para la proteína S no glicosilada, las poblaciones están unidas en un 70 %, 23 % arriba pero no unidas y sólo el 7% hacia abajo (Fig. 3b). El escaneo mutacional profundo del RBD encontró que cualquier mutación en N343, que elimina el glucano unido en esta posición, es perjudicial para la unión, con un ΔΔG inferido de +0,35 a 2,03 kcal/mol48. Usando nuestras tasas de apertura/cierre aproximadas para la proteína S no glicosilada pero modificando las tasas de unión/desunión de acuerdo con los datos de la mutación, encontramos que la población en estado unido disminuye entre un 8 % (ΔΔG = 2,03 kcal/mol; Fig. 3d) y 57% (ΔΔG = 0,35 kcal/mol; Fig. 3c). Por lo tanto, aunque la eliminación de todos los glucanos aumenta la favorabilidad del estado activo, una reducción asociada en la afinidad de unión podría eliminar la ganancia esperada en la población unida a ACE2 (Fig. 3e).

a Las transiciones entre los estados RBD-abajo, arriba y límite se muestran con sus tasas asociadas. b–d Fracción de proteínas S en cada estado (arriba, abajo y unida a ACE2) en diferentes condiciones, a saber, b sin glicanos, c sin glicanos y un aumento supuesto en la energía libre de unión de RBD a ACE2 de 0,35 kcal/mol, yd sin glicanos y con un aumento de la energía libre de unión de 2,03 kcal/mol. e Fracción de estado ligado en equilibrio para las tres condiciones en (b–d).

Para caracterizar mejor los efectos de los glicanos en la energía de la apertura de picos, examinamos cómo el RBD interactúa con el resto de la proteína cuando los glicanos están presentes o ausentes en las simulaciones de REUS. Calculamos el número de enlaces de hidrógeno entre la apertura RBD-A y el resto de la proteína y lo trazamos a lo largo del parámetro de ruta (Figs. 4a, b, S2). Descubrimos que este número disminuye generalmente a medida que se abre RBD-A, con un claro aumento en las interacciones después de cruzar la barrera energética, más con glicanos que sin ellos. El número total de enlaces de hidrógeno formados con RBD-A es mayor para el sistema glicosilado, especialmente en el estado inactivo. Sin embargo, si solo tenemos en cuenta los enlaces de hidrógeno proteína-proteína, el RBD-A no glicosilado pudo formar más conexiones con los otros dominios proteicos. La tendencia general a la baja en las interacciones se explica por el hecho de que RBD-A se aleja del resto de la proteína a medida que se abre y, en consecuencia, rompe el contacto con el resto de la proteína S trimérica, incluidos los dominios S2 y RBD vecinos. Sin embargo, este movimiento es insuficiente por sí solo para explicar el aumento de las interacciones después de cruzar la barrera energética, así como las otras diferencias entre las simulaciones glicosiladas y no glicosiladas.

a, b A lo largo de los MEP como lo indica el parámetro de ruta λ (ver Fig. S2), el número de enlaces de hidrógeno formados entre la apertura RBD-A y el resto del pico se cuentan y clasifican por dominio para el a glicosilado y el b sistemas no glicosilados. Las ubicaciones de los pozos de energía de estado bajo y alto se muestran con fondos blancos, mientras que otras regiones están sombreadas en gris. c, d El número promedio de contactos para el sistema glicosilado formado entre los glicanos en c N122 y d N165 y la cadena β vecina de NTD-B (165–172) y RBD-A (353–360), que de otro modo sería forman enlaces de hidrógeno entre sí si no están separados por los glicanos. e Instantánea de la simulación REUS que muestra los glicanos en N165 y N122 interrumpiendo la formación de enlaces de hidrógeno entre RBD-A y NTD-B, desestabilizando el estado activo en comparación con el sistema no glicosilado.

Profundizar en los cambios en la composición de los enlaces de hidrógeno a lo largo del MEP revela más sobre el papel de los glicanos en la transición de estado de abajo a arriba. Si bien RBD-A forma la mayoría de sus enlaces de hidrógeno con los otros dos RBD y la hélice HR1/CH de la unidad S2 cuando está en estado inactivo, cambia drásticamente para interactuar solo con los vecinos NTD-B y RBD-C. en estado activo (Figs. 4a, b, S3). Durante esta transición, hay una escasez de enlaces de hidrógeno estabilizadores, lo que contribuye a la barrera energética como se ve en los PMF. Con la inclusión de los glicanos, forman interacciones adicionales para estabilizar la proteína, pero también compiten con las interacciones proteína-proteína antes mencionadas. En una estructura reducida compacta, los enlaces de hidrógeno proteína-proteína existentes están protegidos de la exposición a los glucanos, lo que permite que los glucanos formen nuevas interacciones en la superficie de la proteína, lo que resulta en un aumento general del número de enlaces de hidrógeno formados con RBD-A en comparación con el sistema no glicosilado. Sin embargo, tal protección no ocurre en el estado activo. Con RBD-A arriba y expuesto, sus interacciones con NTD-B son limitadas. Específicamente, la mayoría de los enlaces de hidrógeno entre RBD-A y NTD-B se desplazan por interacciones con los glucanos en N165 y N122 una vez que RBD-A se eleva lo suficiente como para que se intercalen entre ellos (Fig. 4c-e). Como resultado, los glicanos favorecen indirectamente el estado inactivo, contribuyendo a la mayor energía libre del estado activo para el sistema glicosilado.

Extender nuestro análisis de enlaces de hidrógeno más allá del MEP y a todo el espacio variable colectivo 2D mejora nuestra comprensión de las diferencias entre los paisajes de energía libre de las simulaciones REUS con y sin glicanos. Trazamos el número promedio de enlaces de hidrógeno entre la abertura RBD-A y su vecino NTD-B como una función de las dos variables colectivas, d y ϕ, mostrando que el aumento en las interacciones entre RBD-A y NTD-B no se limita a estados a lo largo del MEP pero también incluye una gran región en el lado + d de la barrera de energía (Fig. S4a). Curiosamente, la cantidad de enlaces de hidrógeno entre RBD-A y NTD-B alcanza su punto máximo en ϕ = 40∘ y disminuye lentamente a medida que ϕ aumenta, haciéndose eco del resultado anterior de que cuando RBD-A se aleja más de NTD-B, los glicanos intervienen y bloquean interacciones entre los dos dominios. En el lado − d de la barrera de energía, sucede lo contrario para los enlaces de hidrógeno entre RBD-A y RBD-C, donde RBD-A y RBD-C están más cerca entre sí cuando ϕ es grande y, por lo tanto, tiene el número más alto. de enlaces de hidrógeno (Fig. S4b). Esta observación explica la torcedura del MEP al cruzar la barrera energética para el sistema glicosilado. Para maximizar la cantidad de enlaces de hidrógeno que estabilizan RBD-A, el pico sale del pozo de energía del estado inferior con un ϕ grande para mantener el contacto máximo entre RBD-A y RBD-C, antes de cambiar abruptamente a un ϕ más pequeño al entrar en el pozo de energía up-state para maximizar el contacto con NTD-B.

Para evaluar la dinámica a largo plazo de los glicanos, realizamos dos simulaciones de equilibrio de 2 μs de los sistemas glicosilados y no glicosilados. Cuando se proyectó sobre las dos variables colectivas utilizadas en REUS, los tres protómeros en estado inactivo para ambas réplicas permanecieron en conformación inactiva, con y sin glicanos (Fig. S5). Aunque no se produjo ninguna transición entre los estados ascendente y descendente durante las simulaciones de equilibrio, los estados ascendentes exhiben una flexibilidad mucho mayor que los estados descendentes tanto para los sistemas glicosilados como para los no glicosilados, lo que refleja la diferencia de tamaño entre los dos pozos de energía tal como se encontró. de las simulaciones de REUS. Curiosamente, mientras que el RBD-A no glicosilado muestrea alrededor del mínimo de energía del estado superior sin un sesgo direccional obvio, el RBD-A glicosilado muestra una tendencia a moverse hacia la dirección - d desde el mínimo del estado superior a lo largo del MEP. Este resultado, nuevamente, se alinea con las simulaciones de REUS que muestran que el pozo de energía del estado superior para el sistema glicosilado tiene un gradiente más pequeño hacia la barrera de energía que alejándose de ella, mientras que el del sistema no glicosilado es más simétrico (Fig. 2c).

También analizamos las interacciones de los glicanos alrededor de RBD-A, es decir, aquellos en N165, N234 y N343 de la cadena vecina B, utilizando las simulaciones de equilibrio y las trayectorias de REUS a lo largo del MEP. Recientemente, Amaro y sus compañeros de trabajo realizaron simulaciones MD de todos los átomos y experimentos de mutación para estudiar las funciones individuales de los glicanos anteriores en la apertura de picos26,32. De acuerdo con sus resultados, observamos la oscilación del glucano en N234 de apuntar hacia afuera hacia adentro durante la apertura de la punta, así como el efecto de activación del glucano por el glucano en N343 (Película complementaria 2).

Nuestras simulaciones también revelan los roles de los glucanos en N165 y N343 en la estabilización de los estados alcistas y depresivos. Específicamente, cuando RBD-A está en estado inactivo, los glicanos en N165 y N343 envuelven el RBM (Fig. 5a), manteniéndolo en estado inactivo. Se observó una interacción similar en otro estudio cuando se introdujo artificialmente un glicano en N370; envolvía el RBD del sur del estado como un "cordón de zapato"21. Sorprendentemente, el glicano en N165 también estabiliza el RBD en estado superior al soportar parte del RBM expuesto (Fig. 5b). El contacto entre glicanos entre los glicanos en N343 y N165 es significativamente mayor en el estado activo en comparación con el estado inferior (Fig. S6), lo que sugiere que el glicano en N343 estabiliza indirectamente el estado superior al interactuar con el glicano en N165 (Fig. 5b). Los dos glicanos también evitan que el RBM flexible se adhiera al RBD de estado inferior vecino y se vuelva inaccesible para ACE2, como se observa en una de nuestras simulaciones de equilibrio del sistema no glicosilado (Fig. S7).

Ubicaciones representativas de glucanos de proteína S en N165, N234 y N343 en estados de proteína S a abajo y b arriba extraídos de las trayectorias de REUS. c Representación superficial de los residuos de RBD en los estados (arriba) abajo y (abajo) arriba que hacen contacto con los glicanos en N165 (verde) y N343 (naranja). El patrón de rayas cruzadas indica contactos con ambos glicanos. Los estados ascendente y descendente de la proteína S se seleccionaron del MEP.

Las observaciones anteriores son confirmadas por el análisis de contacto en las trayectorias de REUS a lo largo del MEP. Los glicanos en N165 y N343 interactúan con el RBM en el estado inactivo, como lo ilustran los valores de contacto promedio entre RBD-A y los glicanos en N165 y N343 (Figs. S8, S9). A medida que se abre el pico, el glicano en N165 cambia para interactuar con los residuos de RBD-A debajo del RBM, mientras que el glicano en N343 apenas entra en contacto con RBD-A después de que el sistema cruza la barrera de activación de apertura (Fig. 5c). El análisis de contacto para el estado inactivo también captura los residuos de RBM (F456, R457, Y489 y F490) involucrados en la activación de glicanos, como informaron previamente Sztain et al.32.

Las estructuras crio-EM de proteína S a menudo incluyen una doble mutación de prolina, K986P/V987P, ubicada en el giro entre HR1 y CH. Estudios anteriores sobre el SARS-CoV y el MERS-CoV, junto con otras proteínas de fusión de clase I, establecieron que la presencia de este par de prolinas en el giro HR1-CH estabiliza la estructura del pico previo a la fusión y aumenta la expresión de proteínas, ambos aspectos importantes de la vacuna. diseño49. La estructura de la proteína S de Cai et al.12 retiene la secuencia WT K986/V987, en lugar de las mutaciones dobles de prolina que se producen comúnmente en la producción de proteínas de pico de prefusión estabilizadas; informan un desplazamiento hacia el interior (y, por lo tanto, un empaquetamiento más apretado) de las subunidades S1 en comparación con las estructuras de ectodominio solubilizadas anteriormente12. De hecho, la pérdida de un puente salino putativo entre K986 y un ácido aspártico (D427/D428) en un protómero adyacente se ha implicado en la producción de estructuras empaquetadas menos estrechamente observadas en las construcciones mutantes solubilizadas12. Gobeil et al.11 informan que para la construcción de proteína S D614 con el sitio de furina eliminado, la presencia de prolinas produce estructuras, unión a ACE2, estabilidad térmica y unión a anticuerpos que son notablemente similares al par WT K986/V987. En nuestras simulaciones de equilibrio, este puente salino tiene una ocupación de ~30 %, promediada sobre los tres protómeros en las dos trayectorias independientes. La reducción en la ocupación del puente salino antes mencionado se origina por la competencia con los puentes salinos intraprotómeros entre K986 y los residuos ácidos cercanos E748, E990 y D985, presentes en el rango de ~15-25 %, lo que sugiere una interacción transitoria entre K986 y los ácidos aspárticos RBD ( D427/D428). Estas interacciones competitivas se ilustran en la Fig. S10.

Repetimos la simulación REUS con la mutación de diprolina para el sistema no glicosilado. El PMF resultante muestra una modesta diferencia de energía entre los estados RBD hacia abajo y hacia arriba que favorecen el estado hacia arriba (Fig. S11), similar a la que se ve en el WT PMF (Fig. 2b) para estas construcciones D614 ancestrales. La similitud entre los pozos de energía de estado bajo y alto en comparación con los de WT (Fig. 2b) sugiere que la mutación de diprolina produce solo una perturbación modesta de sus poblaciones relativas en estos sistemas no glicosilados. En contraste con los mínimos, se ve que la barrera en el mutante de diprolina aumenta, lo que sugiere una modulación de la cinética de apertura. Dada la naturaleza transitoria de los puentes salinos K986 y las energías relativas similares de los estados RBD abajo/arriba, es probable que un impacto adicional de las mutaciones de prolina sea su tendencia a romper y distorsionar las hélices α. La región de giro de HR1-CH experimenta un gran cambio conformacional en la transición de los estados previos a los posteriores a la fusión, formando una hélice α extendida12. La presencia de las prolinas, residuos que se sabe que rompen/torcen las hélices α, inhibe la formación de la hélice α larga característica de la conformación posterior a la fusión49. Es de destacar que las simulaciones recientes de Wang et al.50 que exploran la transición de los estados previos a los posteriores a la fusión han demostrado que, si bien la secuencia WT en 986/987 tiene una tendencia a volverse helicoidal, el reemplazo con prolinas interrumpe la formación de este secundario. estructura.

Actualmente, se han descubierto casi diez mil anticuerpos neutralizantes dirigidos a la proteína S del SARS-CoV-2. El objetivo más destacado es la proteína S RBD51,52, aunque algunos se dirigen a los NTD y otros epítopos no RBD53. Según la base de datos CoV-AbDab54, que se actualiza continuamente, un total de 9906 (y en aumento) anticuerpos neutralizantes se dirigen a la proteína S, mientras que solo 3955 se dirigen a epítopos no RBD. Una ventaja de dirigirse a epítopos que no son RBD en la proteína S es que pueden reconocerse incluso cuando el RBD está en una conformación descendente20,55. Por el contrario, el RBD solo se puede identificar en la conformación ascendente debido a la fuerte cobertura de glicanos del RBD en la conformación descendente26.

Para comprender el efecto de la dinámica de apertura de picos en la exposición de epítopos, calculamos el área de superficie accesible de varios epítopos a lo largo del MEP identificado de REUS. Seleccionamos siete anticuerpos diferentes16,17,56,57,58,59,60 con epítopos que abarcan múltiples regiones en RBD-A (incluidos los epítopos crípticos) y el NTD-B de la proteína S. Los detalles de estos anticuerpos se proporcionan en la Tabla S3. Realizamos cálculos separados del área de superficie accesible de anticuerpos (AbASA), incluyendo y excluyendo los glicanos utilizando el mismo enfoque de muestreo con una sonda de 7 Å. En estudios previos se utilizó una sonda de tamaño similar20 así como una más pequeña33. Si bien este tamaño de sonda moderado (7 Å) puede hacer que algunas grietas parezcan ligeramente expuestas20, es óptimo para epítopos crípticos33.

En general, AbASA permanece igual o aumenta significativamente cuando RBD-A pasa al estado superior. El epítopo del anticuerpo STE90-C1159 tiene un salto en AbASA durante la transición de abajo a arriba. El anticuerpo CR3022 se une a un epítopo críptico57, que está completamente cubierto en el estado inactivo y solo está ligeramente expuesto en el estado activo. Los residuos de proteínas cubren este epítopo de manera similar a lo largo de la ruta de apertura de picos para los eurodiputados con y sin glicanos (Fig. S12). Sorprendentemente, el AbASA del anticuerpo 2-4 no cambia durante la transición de abajo a arriba del RBD, a pesar de que el epítopo se encuentra en el RBM (Fig. 6a). Por lo tanto, concluimos que todo el RBM no queda expuesto ni siquiera en estado activo. El AbASA para el epítopo del anticuerpo 4A8 no cambia significativamente durante la apertura de la espiga ya que su epítopo está ubicado en el N-terminal17, que no sufrió cambios conformacionales. El AbASA del epítopo de S2M11 no cambia a lo largo de la ruta de apertura de la espiga. Además, parte del epítopo de S2M11 está en el RBD del protómero adyacente, que no se abre en nuestras simulaciones. El epítopo del anticuerpo S2M1160 se superpone ligeramente con el RBD de un protómero (residuos 440, 441 y 444), mientras que la mayoría coincide con el sitio de unión del glicano ACE2 en N322 en el RBD (residuos 369, 371 a 374 y 440)61. Sorprendentemente, el epítopo del anticuerpo S30958 se vuelve menos expuesto en el estado activo sin un aumento en la cobertura de los glucanos (Fig. 6b), lo que indica que una parte del RBD (Tabla S3) también se expone menos en el estado activo en comparación con el estado abajo.

a Área expuesta en epítopos de anticuerpos (AbASA) en presencia de proteínas y glicanos. b Área de superficie de epítopos cubiertos por glicanos a lo largo del MEP cuantificada restando los dos valores de AbASA calculados con y sin glicanos. Todos los cálculos del área de superficie accesible se realizaron con una sonda de 7 Å.

Es de destacar que los epítopos de los anticuerpos elegidos aquí se encuentran en el NTD y RBD de la espiga, las regiones primarias de mutaciones variantes con evasión de neutralización eficaz5,62,63. Los anticuerpos impactados incluyen STE90-C11, 4-8, S2M11, BD-368-2 de Omicron BA.162,64,65 y mayor escape de S309 de Omicron BA.2, BA.4/BA.563. En este último caso, la pérdida de neutralización involucra una región próxima al glicano N343, destacando el importante papel de los glicanos en la respuesta inmune.

La infección por SARS-CoV-2 se inicia cuando un receptor ACE2 se une a la proteína S, que se interconvierte entre estados ascendentes y descendentes y solo el estado ascendente permite la unión de ACE2. En consecuencia, la energía de la interconversión controla el inicio de la infección. Con este fin, calculamos un panorama energético bidimensional de la interconversión ascendente-descendente de la proteína SARS-CoV-2 S. Usando un total agregado de 160 μs de cálculos REUS, aclaramos los roles colectivos de los glucanos de proteína S en su dinámica de apertura. Nuestros resultados indican que la barrera de energía libre de la apertura de la espiga es ~7 kcal/mol más alta en presencia de glicanos en comparación con la espiga completamente no glicosilada. Mientras que la energía libre favorece en gran medida el estado inactivo en presencia de los glicanos, la diferencia de energía entre los dos estados de la proteína S disminuyó por debajo del error estadístico sin los glicanos. Se puede suponer que más proteínas S en el estado superior presentarían una mayor probabilidad de unirse a los receptores ACE2 y, por lo tanto, aumentar su aptitud viral. Sin embargo, hay algunos efectos opuestos de tener más proteínas S en el estado superior, como lo indican estudios previos26,66 y reafirmado por nuestro análisis. El RBD en estado inactivo está fuertemente protegido por glicanos20,26, mientras que en estado activo está más expuesto a anticuerpos neutralizantes (Fig. 6a). Además, la unión de ACE2 depende en gran medida de la afinidad de unión entre ACE2 y la proteína S, lo que puede implicar interacciones con glucanos y proteínas. Por lo tanto, una población alta en el norte del estado no necesariamente refleja una población alta en el estado con límite de ACE2.

La descripción del nivel atómico descrita aquí, y en otros lugares26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, se vuelve particularmente relevante a la luz del papel central que desempeña la dinámica en el funcionamiento de la proteína espiga. Aunque las estructuras crio-EM han sido una pieza central en la delineación de estos estados, las transiciones entre ellos y los estados intermedios no están disponibles. MD proporciona una herramienta complementaria a estos estudios experimentales para lograr una imagen más completa del funcionamiento de estas proteínas, incluidos los efectos cinéticos de los glicanos alterados. Además, incluso las poblaciones relativas de los estados hacia abajo y hacia arriba no están exentas de cierta incertidumbre. Por ejemplo, aunque la estructura crio-EM reciente de la variante del ectodominio Omicron tiene predominantemente RBD67 1 arriba, se informan poblaciones alternativas68 y el pico de longitud completa parece apoyar un conjunto de RBD 2 arriba/1 abajo69. Tal diversidad de conformaciones es probablemente el resultado de construcciones alternativas y/o condiciones experimentales68.

Los epítopos de los anticuerpos en la espiga pueden estar protegidos por residuos de proteína o por glucanos, y la cobertura proporcionada por cada uno cambia de manera dependiente del epítopo a lo largo de la ruta de apertura de la espiga. El anticuerpo STE90-C11 tiene la mayor exposición al epítopo cuando el RBD está arriba, mientras que el anticuerpo BD-368-2 tiene un epítopo que siempre está significativamente expuesto, independientemente de la posición del RBD. Además, la exposición del epítopo BD-368-2 es muy similar al epítopo de STE90-C11 en estado activo. Por lo tanto, estos dos anticuerpos muestran una eficacia muy alta en la neutralización de la proteína S del SARS-CoV-2, ambos con valores subnanomolares de IC5056,59. El anticuerpo CR3022 se une a un epítopo críptico; en consecuencia, su AbASA es menor en comparación con otros epítopos. Sin embargo, la falta de superficie expuesta, incluso en estado activo, se compensa con fuertes interacciones electrostáticas en la interfase epítopo-CR302270. Tenga en cuenta que el S309 Fab se une a un epítopo de proteoglicano, que incluye el glicano en N343. Sin embargo, dado que la mayor parte del epítopo S309 no forma parte de la RBM, puede adherirse a la proteína del pico tanto en estado inactivo como inactivo58. El efecto puede anularse mediante mutaciones cerca de N343, como se observa para la variante Omicron63.

Analizamos las interacciones de glicanos individuales con diferentes dominios de la proteína S utilizando los dos eurodiputados obtenidos, uno con y otro sin glicanos. Los glicanos en N122 y N165 interrumpen los enlaces de hidrógeno entre el RBD-A de apertura y el NTD-B vecino, desestabilizando el estado alto y, por lo tanto, empujando la población en equilibrio hacia el estado bajo en comparación con el sistema no glicosilado. Los glicanos en N165 y N343 también estabilizan el estado de inactividad de RBD-A al envolver el RBM. Por el contrario, el glicano en N343 sirve como la llamada "puerta de glicano" que apuntala el RBM32, mientras que el glicano en N165 ayuda al respaldar el estado superior RBD-A con la ayuda del glicano en N343. En consecuencia, estos dos glicanos estabilizan tanto los estados bajos como los altos, contribuyendo a un mínimo de energía local para cada uno. El papel complicado del glucano en N165 puede explicar los resultados experimentales contradictorios con respecto a si la mutación N165A aumenta o disminuye la unión de picos26,71.

La proteína espiga es el objetivo principal de los anticuerpos neutralizantes, presenta una variedad de epítopos en los estados alto y bajo, y es la base de las vacunas y refuerzos actuales5,15,16,17. Bajo la presión evolutiva, la espiga está mutando rápidamente, con la aparición de variantes más transmisibles con un mayor escape de anticuerpos5. Aunque el virus continúa mutando, hasta la fecha, las vacunas y los refuerzos parecen brindar una protección adecuada. Un enfoque eficaz para tratar la pandemia prolongada sigue siendo la identificación y evaluación de regiones inmunológicas importantes en la espiga, tanto en el estado bajo como en el alto, así como las transiciones entre ellas, particularmente porque parece que la espiga continuará mutando y potencialmente comprometerá el vacunas/refuerzos actuales. Dada la estructura y la dinámica alteradas informadas para las variantes de pico de SARS-CoV-211,25,67,68, es necesaria una descripción detallada de la energía y la cinética para la apertura de la proteína de pico, y los enfoques computacionales como se describe aquí proporcionan un complemento valioso herramienta en el desarrollo de tratamientos efectivos.

Para cerrar, calculamos la energía a lo largo del camino de apertura de picos para la proteína SARS-CoV-2 S con información a nivel atómico sobre las funciones de los glicanos en el proceso de apertura. Además, destacamos cómo la energía de apertura de picos afecta la cinética de la exposición del epítopo y la unión de ACE2. Estos hallazgos, especialmente las conformaciones a lo largo del camino de apertura de la punta, facilitarán el diseño de nanocuerpos y anticuerpos efectivos para combatir la crisis actual de COVID-19.

Modelamos los estados arriba y abajo basados ​​en las estructuras de microscopía crioelectrónica (cryo-EM) de Walls et al.10 (PDB: 6VYB) y de Cai et al.12 (PDB: 6XR8) utilizando VMD72. La estructura del estado descendente informada por Cai et al. es una construcción de proteína S WT de longitud completa purificada con detergente con una resolución de 2,9 Å12. Exhibe varias diferencias críticas con estructuras informadas anteriormente: (i) NTD más resuelto con un sitio de glicosilación adicional en N17, (ii) la secuencia WT en la región central de hélice/bucle, en lugar de la mutación 2PP estabilizadora previa a la fusión, y ( iii) un segmento de aproximadamente 25 residuos de largo, residuos 828-853, que no estaban resueltos previamente. Esta última región está adyacente a una lisina crítica (K854) que proporciona un compañero de puente salino para D614. La pérdida de este puente salino se ha implicado en el aumento de la infectividad de las cepas D614G SARS-CoV-2. Además, Cai et al.12 también resolvieron dos enlaces disulfuro que antes faltaban, uno en el N-terminal (C15-C136) y otro en la región central de hélice/bucle (C840-C851). En nuestro modelo, los residuos que faltan en las estructuras de estado inferior se agregaron con SWISS model73 utilizando la estructura 6XR8 como plantilla. El modelo se escindió en el sitio de escisión de furina entre los residuos R685 y S686. La parte S1, que contiene RBD y NTD, está más empaquetada en la estructura 6XR8 en comparación con 6VXX, y la parte S2, que contiene HR1 y CH, está alineada entre ellos12. La parte S1 y S2 de nuestro modelo incluye los residuos N14-R685 y S686-S1147, respectivamente. Se agregan diez enlaces disulfuro en la parte S1 entre los residuos C15-C136, C131-C166, C291-C301, C336-C361, C379-C432, C391-C525, C480-C488, C538-C590, C617-C649 y C662- C671 y cinco se agregan a la parte S2 C738-C760, C743-C749, C840-C851, C1032-C1043 y C1082-C1126. Las partes faltantes en el estado activo se modelaron utilizando el modelo minimizado del estado inferior. Los sitios de glicosilación están ubicados en N17, N61, N74, N122, N149, N165, N234, N282, T323, N331, N343, N603, N616, N657, N709, N717, N801, N1074, N1098 y N1134. En general, hay 19 glucanos unidos a N y 1 glucanos unidos a O presentes en cada protómero, lo que da como resultado un total de 60 glucanos para un modelo de trímero de proteína S. El glicano de cada sitio con la población más alta en los datos de espectroscopia de masas de Crispin y colaboradores19 se agregó al sitio utilizando el servidor web GLYCAM desarrollado por el grupo Woods (http://glicam.org)37,38. Las composiciones de glicanos se ilustran en la Fig. S13. Los átomos de hidrógeno faltantes se agregaron a todos los sistemas, después de lo cual se solvataron en una caja de agua de 195 × 193 × 212 Å3. Agregamos iones de Na+ y Cl- para lograr una concentración de sal de ~0,150 M. El número de átomos en proteína, agua, glucano e iones se mantuvo igual para los cálculos de REUS. Los sistemas (estados arriba o abajo) contienen un total de 758 531 átomos (63 312 átomos de proteína y glicano, 661 Na+, 652 Cl-) y 633 864 átomos (52 476 átomos de proteína, 549 Na+, 546 Cl-) con y sin glicanos, respectivamente. La diferencia en la cantidad de iones surge de (1) la caja de agua más grande necesaria para acomodar los glicanos y (2) la carga negativa del ácido siálico (marcado como Neu5Ac en la Fig. S13) presente en los glicanos unidos a O.

Todas las simulaciones se realizaron utilizando NAMD 2.1474,75 con el campo de fuerza de proteína CHARMM36m76, el campo de fuerza de glicano CHARMM3677 y el agua TIP3P78. Cada sistema se equilibró durante 5 ns con la temperatura y la presión fijadas en 310 K y 1 atm, respectivamente, usando dinámica de Langevin y pistón79, respectivamente. Se empleó un paso de tiempo uniforme de 4 fs mediante el uso de repartición de masa de hidrógeno (HMR)80,81. La electrostática de largo alcance se calculó en cada paso de tiempo usando el método Ewald de malla de partículas82. Se estableció un límite de corto alcance para las interacciones de Lennard-Jones en 12 Å, con una función de conmutación que comienza en 10 Å. Los enlaces que involucran átomos de hidrógeno se restringieron a su longitud de equilibrio, empleando el algoritmo SETTLE para moléculas de agua y el algoritmo SHAKE para todos los demás.

Después del equilibrio, realizamos dos simulaciones metadinámicas independientes a lo largo de las dos variables colectivas d y ϕ (definidas en la Fig. 1) para cada sistema (WT glicosilado, WT no glicosilado y no glicosilado con mutación de diprolina), una comenzando desde el estado hacia abajo y uno del estado de arriba. Se utilizó el módulo colvars de NAMD para construir todas las variables colectivas83. Los sesgos se depositaron con una altura de colina de 0,2 kcal/mol, un ancho de 1,0 Å y 1,0∘ para d y ϕ, respectivamente, y una tasa de 1 ps−1. Los sistemas se limitaron a d y ϕ dentro del rango de las estructuras crio-EM de los estados hacia abajo (PDB: 6XR8) y hacia arriba (PDB: 6VYB). La temperatura se mantuvo a 310 K utilizando la dinámica de Langevin y el volumen se mantuvo constante.

Luego usamos las trayectorias metadinámicas para sembrar las ejecuciones de REUS de acuerdo con el siguiente procedimiento. Para cada sistema, se generaron dos PMF preliminares, uno de la metadinámica del estado inferior y otro del estado superior. El espacio conformacional se dividió en pequeñas cuadrículas y cada cuadrícula se convirtió en una sola ventana REUS en la siguiente etapa. Las ventanas que tienen sus PMF de la metadinámica de estado bajo y alto por debajo de un cierto umbral (Tabla S2) se eliminaron y no se usarían en la simulación REUS. Para las cuadrículas restantes, elegimos una instantánea de la trayectoria metadinámica del estado descendente (Fdown) o ascendente (Fup) de acuerdo con el peso de Boltzmann de su PMF respectivo.

Si Pdown > Pup, se seleccionó una instantánea de la trayectoria metadinámica de estado descendente para esa cuadrícula y viceversa. Con esto, se seleccionaron 387 ventanas (181 de abajo, 206 de arriba) para el sistema glicosilado WT; 392 ventanas (79 desde abajo, 313 desde arriba) para el sistema WT no glicosilado; y 353 ventanas (119 desde abajo, 234 desde arriba) para el sistema no glicosilado con mutación de diprolina.

Para el sistema glicosilado, realizamos un recocido simulado en los glicanos para todas las instantáneas extraídas de las simulaciones metadinámicas. A partir de 1000 K, los sistemas se enfriaron lentamente hasta la temperatura fisiológica en pasos de 823 K, 677 K, 557 K, 458 K, 377 K y 310 K. Cada temperatura se ejecutó durante 2 ns. Durante la simulación, se fijaron todos los átomos de proteína y se permitió que los glucanos, las moléculas de agua y los iones se movieran libremente. Debido a las altas velocidades de los átomos a 1000 K y 823 K, se utilizó un paso de tiempo de 2 fs junto con HMR. Para temperaturas menores o iguales a 677 K se utilizó un paso de tiempo de 4 fs con HMR. Otros parámetros de simulación eran idénticos a los utilizados anteriormente. Se confirmó que las conformaciones de anillo finales de los glicanos eran consistentes con los valores esperados (Fig. S14).

Con las configuraciones iniciales preparadas, ejecutamos simulaciones REUS para cada sistema a lo largo de d y ϕ dentro de las regiones seleccionadas de acuerdo con la simulación de metadinámica PMF. Los rangos de d y ϕ van de 44,0 Å a 72,5 Å y de –56,0∘ a 1,0∘, respectivamente. Las constantes de fuerza de restricción a lo largo de d y los centros de las ventanas se ajustaron para garantizar una superposición e intercambio suficientes entre las ventanas vecinas. Las constantes de fuerza a lo largo de ϕ se mantuvieron constantes en 1,0 kcal mol−1deg−2. Las simulaciones REUS del sistema glicosilado WT, el sistema no glicosilado WT y el sistema no glicosilado con mutación de diprolina se realizaron durante 32 ns, 36 ns y 29 ns, respectivamente. Los parámetros de simulación fueron idénticos a los utilizados en las simulaciones de metadinámica. Los datos de muestreo de REUS se usaron para calcular el PMF para cada sistema usando el índice de aceptación de Bennett multiestado (MBAR), implementado en el módulo de Python pymbar84. Para los sistemas WT glicosilados y no glicosilados, realizamos tres rondas más de simulaciones REUS utilizando instantáneas extraídas de las rondas anteriores de manera similar a las simulaciones metadinámicas. Para la segunda ronda, las regiones de simulación se volvieron a seleccionar utilizando un nuevo corte de energía basado en los PMF calculados a partir de la primera ronda de REUS (Tabla S2). También se recalibraron las constantes de fuerza de contención y los centros de las ventanas. La segunda ronda de REUS para los sistemas WT glicosilados y no glicosilados se ejecutó durante 37 ns y 56 ns, respectivamente. A la luz del resultado de la segunda ronda de REUS, ejecutamos una tercera ronda de REUS, expandiendo la región PMF para cubrir completamente los dos pozos de energía. Se ejecutaron dos simulaciones REUS independientes durante la tercera ronda para cada uno de los pozos de energía. Los rangos de d y ϕ fueron de 40,5 Å a 51,0 Å y de –66,5∘ a –21,5∘, respectivamente, para el REUS de estado inferior. Los rangos de d y ϕ fueron de 57,5 ​​Å a 99,5 Å y de –35,5∘ a 45,5∘, respectivamente, para el REUS del estado superior. Se ejecutaron nuevas simulaciones de metadinámica para sembrar regiones nunca muestreadas por simulaciones REUS anteriores. Nuevamente, las ventanas se seleccionaron en función de un nuevo corte de energía (Tabla S2), y las constantes de fuerza de restricción y los centros de las ventanas se calibraron para maximizar la superposición y los intercambios entre ventanas vecinas. Las terceras rondas de REUS para los sistemas de estado descendente y ascendente glicosilados WT se ejecutaron durante 16 ns y 12 ns, respectivamente, y las del sistema no glicosilado fueron 33 ns y 28 ns, respectivamente. Finalmente, se llevó a cabo una última ronda de REUS para cubrir todo el rango desde abajo hasta arriba del estado. Se adoptaron todas las ventanas de las rondas 2 y 3, y se agregaron algunas en los bordes para garantizar que se cubrieran todas las regiones de baja energía (Tabla S2). El REUS para el sistema no glicosilado WT se ejecutó durante 36 ns directamente utilizando los últimos fotogramas de rondas anteriores de REUS. Para el sistema glicosilado, generamos nuevas estructuras de siembra a partir de REUS no glicosilado para ventanas alrededor de la barrera de energía para ayudar a cerrar la brecha entre las estructuras de estado bajo y alto en la simulación de REUS glicosilado. Usando las estructuras de rondas anteriores de REUS y las estructuras recién generadas de la simulación de REUS no glicosilada completa, la REUS glicosilada se ejecutó durante 36 ns. Los datos presentados para los sistemas WT se basan en la combinación de datos desde la segunda hasta la última ronda de REUS. El tiempo de agregación total de los datos de simulación utilizados para el sistema glicosilado WT, el sistema no glicosilado WT y el sistema no glicosilado con mutación de diprolina REUS fue de 65 μs, 91 μs y 12 μs, respectivamente.

Para las simulaciones de equilibrio, se ejecutaron dos réplicas inicializadas con diferentes semillas aleatorias. Además, hemos evaluado la convergencia de nuestros PMF utilizando las incertidumbres que proporciona MBAR, y todos son inferiores a 0,2 kcal/mol, excepto alrededor de los bordes de los PMF.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen para los PMF en la Fig. 2 se proporcionan como Datos complementarios 1. Las conformaciones de la proteína S, el MEP para cada uno de los tres PMF y los archivos de configuración de NAMD están disponibles en NSF MolSSI COVID-19 Molecular Structure and Therapeutics Hub en https ://covid.molssi.org/simulations/#pmf-calculations-of-sars-cov-2-spike-opening.

VMD y NAMD están disponibles en https://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/ y https://www.ks.uiuc.edu/Research/namd/, respectivamente. La implementación de MBAR utilizada está disponible en https://github.com/choderalab/pymbar.

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Se otorgó un premio de tiempo de computadora en la supercomputadora Summit en el Laboratorio Nacional de Oak Ridge a través del Consorcio de Computación de Alto Rendimiento COVID-19. Se proporcionaron recursos computacionales adicionales a través de Extreme Science and Engineering Discovery Environment (XSEDE; TG-MCB130173), que cuenta con el apoyo de la National Science Foundation (NSF; ACI-1548562). Este trabajo también utilizó el clúster Hive, que cuenta con el apoyo de la NSF con el número de subvención 1828187 y está administrado por la Asociación para un entorno informático avanzado (PACE) en el Instituto de Tecnología de Georgia. Los autores agradecen a Mahmoud Moradi por su orientación en el cálculo del tiempo medio del primer paso. YTP cuenta con el apoyo de una beca Frontera del Centro de Computación Avanzada de Texas (TACC). Frontera cuenta con el apoyo de la subvención NSF No. OAC-1818253.

Atanu Acharya

Dirección actual: BioInspired Syracuse y Departamento de Química, Universidad de Syracuse, Syracuse, NY, 13244, EE. UU.

Estos autores contribuyeron por igual: Yui Tik Pang, Atanu Acharya.

Escuela de Física, Instituto de Tecnología de Georgia, Atlanta, GA, 30332, EE. UU.

Yui Tik Pang, Atanu Acharya, Diane L. Lynch, Anna Pavlova y James C. Gumbart

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investigación diseñada por YTP, AA, DLL y JCG; YTP, AA, DLL y AP realizaron investigaciones y analizaron datos; y todos los autores escribieron el manuscrito.

Correspondencia a James C. Gumbart.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Elisa Fadda, Peter Coveney y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal de manejo: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Pang, YT, Acharya, A., Lynch, DL et al. La dinámica y la energía de apertura de picos del SARS-CoV-2 revelan los roles individuales de los glicanos y su impacto colectivo. Commun Biol 5, 1170 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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Recibido: 01 Septiembre 2021

Aceptado: 20 de octubre de 2022

Publicado: 03 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04138-6

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