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Aug 03, 2023

Estructura y mecanismo de unión a sacarosa del transportador de sacarosa SUC1 de la planta

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La importación de sacarosa de los tejidos fotosintéticos al floema está mediada por transportadores de la familia de transportadores de sacarosa de baja afinidad (familia SUC/SUT). Además, la redistribución de sacarosa a otros tejidos está impulsada por el movimiento de la savia del floema, producto de la alta presión de turgencia creada por esta actividad de importación. Adicionalmente, órganos sumideros como frutas, cereales y semillas que acumulan altas concentraciones de azúcar también dependen de este transporte activo de sacarosa. Aquí presentamos la estructura del simportador de sacarosa-protón, Arabidopsis thaliana SUC1, en una conformación abierta hacia el exterior con una resolución de 2,7 Å, junto con simulaciones de dinámica molecular y caracterización bioquímica. Identificamos el residuo ácido clave requerido para la absorción de sacarosa impulsada por protones y describimos cómo la protonación y la unión de sacarosa están fuertemente acopladas. La unión de sacarosa es un proceso de dos pasos, con el reconocimiento inicial mediado por la unión de la fracción glucosilo directamente al residuo ácido clave de una manera estricta dependiente del pH. Nuestros resultados explican cómo se logra el transporte de sacarosa de baja afinidad en las plantas y señalan una gama de aglutinantes SUC que ayudan a definir la selectividad. Nuestros datos demuestran un nuevo modo para el simporte impulsado por protones con enlaces al simporte impulsado por cationes y proporcionan un modelo amplio para el transporte general de baja afinidad en entornos de sustrato altamente enriquecidos.

La sacarosa es esencial para el crecimiento y desarrollo de las plantas, sirviendo como el metabolito central de la planta, con funciones asociadas adicionales como molécula de señalización1,2,3. En la mayoría de las especies de plantas, la sacarosa es la forma principal de carbono asimilado producido durante la fotosíntesis. La distribución de sacarosa a larga distancia desde los tejidos fuente verdes, generalmente las hojas, hasta los tejidos sumideros que demandan energía está mediada por el floema4. Aquí, los transportadores de azúcar de dos familias, la familia de transportadores de sacarosa (denominada familia SUT/SUC) y la familia SWEET, juegan papeles centrales5,6,7,8. Mientras que los facilitadores SWEET expulsan azúcares, la carga activa depende de los SUC que utilizan la fuerza motriz de protones de la membrana plasmática para impulsar la absorción de sacarosa para su acumulación, con concentraciones que alcanzan hasta 1,3 molar en el floema9,10,11,12,13,14. El movimiento de la savia del floema es producto de la alta presión de turgencia creada por esta actividad SUC6,15. Además, los órganos sumideros, como frutos y semillas, que acumulan altas concentraciones de azúcar en etapas de desarrollo, también dependen del transporte activo de sacarosa por parte de las SUC15,16.

Los SUC forman parte de la familia de simportadores de cationes Glycoside-Pentoside-Hexuronide (GPH) que pertenece a Major Facilitator Superfamily (MFS)17,18. Se sabe que los miembros de la familia GPH transportan una amplia gama de sustratos, desde pequeñas moléculas solubles como glucosa, melibiosa o sacarosa hasta grandes lisolípidos anfifílicos, normalmente acoplados al transporte de cationes monovalentes19,20,21. Los SUC ocupan una posición única en la diversa familia GPH al ser transportadores acoplados a protones y tienen una identidad de secuencia muy baja con otras ramas conocidas (<16%).

A pesar de su papel clave en los procesos fundamentales de la fisiología vegetal, el mecanismo de trabajo de los SUC sigue siendo desconocido. No está claro cómo los SUC reconocen la sacarosa y cómo se acopla el transporte de protones. Al poseer la capacidad de liberar sacarosa en ambientes con concentraciones de sacarosa extremadamente altas, el sitio de unión de sacarosa debe tener características únicas; de hecho, su acoplamiento con el gradiente de protones impulsor debe ser estrecho y estar bien coordinado. Arabidopsis thaliana tiene nueve transportadores SUC (SUC1–9), y SUC1 se encuentra entre los primeros simportadores de sacarosa-H+ identificados (datos extendidos Fig. 1)22,23,24,25,26,27,28. SUC1 se expresa predominantemente en órganos reproductivos, tricomas y raíces, donde se localiza en la membrana plasmática y se requiere para la función adecuada del polen24,29,30,31,32,33.

Aquí presentamos la estructura de A. thaliana SUC1 junto con simulaciones integrales de caracterización bioquímica y dinámica molecular (MD). Nuestro trabajo identifica elementos clave para comprender el transporte de sacarosa acoplado a protones al explicar el reconocimiento del sustrato y cómo los protones se acoplan directamente al transporte de sacarosa en un mecanismo único. Este mecanismo permite la unión y liberación de sacarosa en ambientes con altas concentraciones molares de sacarosa, lo cual es vital para la función adecuada del floema, el transporte a tejidos aislados apoplásticamente y el crecimiento de las plantas.

Para examinar el mecanismo de transporte de los SUC, examinamos una variedad de transportadores SUC e identificamos que A. thaliana SUC1 es estable y se expresa bien en Saccharomyces cerevisiae (Datos extendidos Fig. 2a-d). En los ensayos de captación de ovocitos, SUC1 muestra una captación robusta de sacarosa con una constante de Michaelis aparente (Kmapp) de 1,28 mM (Fig. 1a y Datos extendidos Fig. 3a), comparable con resultados anteriores6,34. La proteína SUC1 purificada se reconstituyó en liposomas y el transporte se midió mediante acoplamiento capacitivo mediante electrofisiología de membrana soportada sólida (SSM). Esto mostró una afinidad robusta pero baja similar por la sacarosa in vitro, con un Kmapp (ensayos de electrofisiología basados ​​en SSM en Métodos) de 19 mM a pH 5.5 (Fig. 1b). Encontramos una fuerte dependencia del pH, con el transporte estimulado por una mayor concentración de protones in vivo y con un óptimo funcional in vitro a un pH simétrico de 5.5 (Datos extendidos Fig. 3b, c).

a, Ensayo de captación de ovocitos para SUC1 a pH 5,5 con ajuste no lineal de Michaelis-Menten. Los puntos de datos son la media ± sd; los puntos representan mediciones biológicamente independientes (n = 4 para concentraciones de 0,8, 1,5, 6 y 15 mM; n = 6 para una concentración de 20 mM; n = 9 para concentraciones de 0,1 y 0,3 mM). b, Corrientes máximas determinadas por electrofisiología basada en SSM en proteoliposomas SUC1 a un pH simétrico de 5,5. El transporte se puede describir mediante la cinética de Michaelis-Menten. Los puntos de datos son la media ± sd (n = 3 experimentos biológicos independientes). El inserto muestra trazas de corriente sin procesar en un rango de concentraciones de sacarosa. c, El mapa de densidad de electrones de 2,7 Å de SUC1 (mapa de 2mFo-DFc contorneado en 1σ). Las densidades correspondientes al dominio N y C están coloreadas en cian y naranja, respectivamente. Los dominios EHR e IHR están coloreados de amarillo pálido. d, Vista lateral de la estructura de SUC1 en el plano de la membrana plasmática, coloreada según dominios. Abajo, una vista superior desde el lado extracelular con M1–M12 etiquetado. Se muestra el puente disulfuro de conexión EHR-M6. e, Topología de SUC1. Los extremos N-terminal (residuos 1-24) y C-terminal (residuos 501-513) desordenados se muestran como guiones.

Datos fuente

Procedimos a resolver la estructura de SUC1 usando cristalografía a una resolución de 2.7 Å (Fig. 1c y Datos extendidos Fig. 2a-d). En la unidad asimétrica, SUC1 forma un dímero invertido no fisiológico, con ambos monómeros en la misma conformación (desviación cuadrática media (rmsd) de los átomos de Cɑ = 0,1 Å). La excelente densidad del mapa permitió la construcción de un modelo atómico final que contenía los residuos 25–500 (de 513 residuos) con un factor R libre (Rfree) del 29,3 % (Fig. 1c, Datos extendidos, Fig. 4 y Tabla complementaria 1). En general, SUC1 adopta el pliegue canónico del transportador MFS con doce hélices transmembrana dispuestas en dos mitades pseudosimétricas que constan de dos dominios de seis hélices, el dominio N-terminal (dominio N, M1–M6) y el dominio C-terminal (dominio C, M7– M12) (Fig. 1d,e). Los dos dominios están conectados por una región conectora citoplasmática corta de 26 residuos, que están bien definidos en el mapa experimental. Es de destacar que el enlazador citoplasmático contiene una hélice ɑ anfipática de 9 residuos (denominada región helicoidal intracelular (IHR)) (Fig. 1c-e y Datos extendidos Figs. 4 y 5a, b). Extracelularmente, una región helicoidal corta (denominada región helicoidal extracelular (EHR)), que también tiene claras propiedades anfipáticas, está presente en la conexión en bucle entre M5 y M6. El EHR está anclado al lado del dominio N mediante un puente disulfuro entre los residuos estrictamente conservados Cys216 y Cys220 (Fig. 1d y datos extendidos Figs. 4, 5a, c y 6). Exploramos los roles de IHR y EHR por mutagénesis y encontramos que la actividad de transporte en los ovocitos parece indiferente a la mutagénesis de los residuos hidrofóbicos en IHR (Datos extendidos Fig. 5b, d). Sin embargo, el EHR en el lado extracelular es muy sensible a los cambios. La interrupción del enlace corto EHR-M6 al mutar Cys216 del puente disulfuro da como resultado la pérdida de transporte. La mutación de los tres residuos (Leu204, Met207 y Phe208) del EHR, que aparecen enterrados en la lámina de la membrana, a residuos de serina polar produce una pérdida de transporte similar, lo que implica un papel importante durante el transporte para esta región extracelular (Datos ampliados Fig. 5e).

La estructura captura SUC1 en una conformación abierta hacia el exterior con una red electrostática conservada entre los dominios N y C en el lado citosólico (datos extendidos, figuras 6 y 7). Una cavidad en forma de V grande y claramente definida, que abarca aproximadamente dos tercios del plano de la membrana entre los dominios N y C, está abierta al lado extracelular (Fig. 2a). En general, la cavidad es electronegativa, pero se vuelve electropositiva hacia el fondo que la encierra. A pesar de la presencia de sacarosa durante la cristalización, no se puede observar una densidad definida para la unión de sacarosa en la cavidad.

a, Vista de losa de SUC1 que muestra la conformación abierta hacia afuera vista desde el plano de la membrana (izquierda) o desde el lado extracelular (derecha). Los recuadros punteados se refieren a las regiones del sitio de unión a H+ y el bolsillo de unión a sacarosa. La superficie está coloreada por el potencial electrostático (kBT e−1). b, Vista de primer plano del sitio de unión de protones que se muestra en a. La distancia entre el par de residuos que constituye el sitio del protón (Asp152 (rojo) y Gln50 (azul)) se indica mediante la flecha discontinua, siendo 8,2 Å la distancia más corta (desde Asp152 ε-oxígeno hasta Gln50 ε-oxígeno/nitrógeno). c, Ensayo de captación de ovocitos para mutantes SUC1 dirigidos al bolsillo del sitio de protones a tres valores de pH externos diferentes. La caja se extiende desde el percentil 25 al 75 y se muestra la mediana. Los bigotes se extienden al valor mínimo y máximo. Los puntos representan experimentos biológicamente independientes (n = 4 para S78A (pH 3,5 y 5,5) y Q456A (pH 3,5); n = 5 para WT (pH 4,5), agua (pH 3,5, 4,5 y 5,5), C74A (pH 5,5), S78A (pH 4,5) y Q456A (pH 4,5) y n = 6 para WT (pH 3,5 y 5,5), W47A (pH 3,5, 4,5 y 5,5), Q50A (pH 3,5, 4,5 y 5,5), C74A (pH 3,5 y 4,5), D152N (pH 3,5, 4,5 y 5,5) y Q456A (pH 5,5)). Los colores corresponden a los residuos en el panel b. d, trazas de corriente sin procesar de electrofisiología basada en SSM para proteoliposomas WT SUC1 (verde pálido a verde oscuro), SUC1-D152N (rojo pálido a rojo oscuro) o SUC1-Q50A (azul pálido a azul oscuro) obtenidos mediante la adición de sacarosa 30 mM al pH simétrico indicado. Los gráficos representan las corrientes máximas. La caja se extiende desde el percentil 25 al 75 y se muestra la mediana. Los bigotes se extienden al valor mínimo y máximo (n = 3, los puntos de datos son experimentos individuales). WT, tipo salvaje.

Datos fuente

El transporte activo de sacarosa por SUC1 está impulsado por protones y es sensible al desacoplador de protones carbonilo cianuro m-clorofenil hidrazona en ensayos de ovocitos (Datos ampliados Fig. 8a). En los transportadores, los residuos ácidos enterrados en la región transmembrana son generalmente esenciales para el transporte de protones35. En los dominios transmembrana de SUC1, el único residuo ácido es Asp152 (M4), que está estrictamente conservado en SUC y, por lo tanto, es el principal candidato como residuo donador/aceptor de protones durante el simporte (Fig. 2b y Figs. de datos extendidos 1 y 6) . Asp152 se expone al solvente de la cavidad sin ningún contacto cercano con otros residuos (Fig. 2b). La mutación de Asp152 a una asparagina resultó en la pérdida de la actividad de transporte sin afectar la localización de la membrana plasmática in vivo (Fig. 2c y Datos extendidos, Fig. 9). Como era de esperar, este mutante también interrumpe la respuesta actual que se observa de otro modo para SUC1 de tipo salvaje en los liposomas, lo que respalda su función clave como donante/aceptor central de protones (Fig. 2d y Datos ampliados, Fig. 8b). Otro requisito general para la translocación de protones transmembrana es el control de pKa del donante/aceptor de protones, que a menudo está mediado por un residuo con carga positiva35,36,37,38. Sin embargo, no hay candidatos obvios para esta función en el estado abierto hacia el exterior de SUC1.

Para obtener un estado orientado hacia adentro, intentamos usar diferentes herramientas de predicción de estructura de proteínas basadas en inteligencia artificial (IA), pero solo obtuvimos conformaciones orientadas hacia afuera similares a nuestra estructura experimental (rmsd de Cɑ 1.6–2.5 Å). Sin embargo, en la estructura, identificamos una red de puentes salinos entre el dominio N y C en el lado intracelular que estabiliza el estado abierto hacia afuera (Datos extendidos Figs. 6 y 7a). La interrupción de estas interacciones condujo a una actividad de transporte inactiva o muy disminuida (Datos extendidos Fig. 7b). Inferimos que la proteína se había estabilizado en el estado orientado hacia adentro por estas mutaciones, y usamos esta información para guiar una herramienta de predicción de estructura de proteína basada en IA para generar la conformación abierta hacia adentro (Datos extendidos Fig. 7a) 39,40. Con base en esta predicción de conformación abierta hacia adentro, sugerimos que el Gln50 (M1) estrictamente conservado es el candidato probable para controlar el pKa de Asp152 (Datos extendidos Fig. 7c). A pesar de estar a 8,2 Å del aspartato en la estructura, Gln50 se desplazó por los movimientos de M1 para formar enlaces de hidrógeno con Asp152 en el modelo abierto hacia adentro previsto (Fig. 2b y datos extendidos, Fig. 7c). La sustitución de Gln50 por alanina condujo a una pérdida de actividad de transporte, comparable en magnitud a D152N en los ovocitos (Fig. 2c). La mutación de otros residuos en la vecindad no mostró ninguna actividad de transporte reducida (Cys74) o mostró una actividad de transporte algo reducida (Ser78 o Gln456), excepto por la sustitución de Trp47, que condujo a una pérdida de transporte comparable al mutante Q50A (Fig. 2c). Además, de manera similar al mutante D152N, el mutante Q50A también mostró la misma pérdida de respuesta actual y dependencia del pH en comparación con SUC1 de tipo salvaje en liposomas (Fig. 2d). En base a esto, proponemos que Asp152 es el aceptor/donante de protones responsable de la translocación de protones durante la simportación que puede involucrar a Gln50 para controlar los cambios de pKa en el sitio de protones.

Desde aquí enfocamos nuestro interés hacia el sitio de unión de sacarosa ubicado en la cavidad en forma de V. Claramente, hay una variedad de residuos de los dominios N y C en la cavidad y cerca del sitio del protón que podrían participar en la unión de la sacarosa (Fig. 3a).

a, Vista de primer plano del bolsillo de unión de sacarosa delineado en azul, como se muestra en la Fig. 2a. b, Resultados de cinco repeticiones de simulación de MD independientes, cada una para Asp152 (H) y Asp152 (-), a partir de la posición de unión estable identificada para la sacarosa. Las repeticiones muestran resultados consistentes, resumidos por la fracción de tiempo en que la sacarosa se unió en la pose estable. A la derecha, se muestra la repetición 2 de las simulaciones con sacarosa como un alfiler, con la cabeza representando el resto glucosilo. A continuación, el gráfico rmsd de sacarosa. El fondo de la gráfica rmsd indica la posición unida (azul oscuro) o no unida (azul claro) de la sacarosa. c, Mapa de contacto entre los átomos de sacarosa y los residuos de SUC1 en la serie MD 2 con Asp152(H). Solo se muestran las interacciones que ocurren durante al menos el 25% del tiempo de simulación, incluidas las interacciones de enlace de hidrógeno (azul) y las interacciones hidrofóbicas (rojo). d, Instantánea representativa de la pose estable de sacarosa en simulaciones con Asp152 (H). Los guiones azules indican enlaces de hidrógeno y los guiones rojos indican interacciones hidrofóbicas. e, Representación esquemática de la coordinación de sacarosa por SUC1 en la instantánea que se muestra en el panel d. f, Ensayo de captación de ovocitos para mutantes SUC1 dirigidos a los residuos que recubren el bolsillo de unión de sacarosa. Las actividades de captación se normalizan a las del tipo salvaje. Las barras son la media ± sd Los puntos representan experimentos biológicamente independientes (n = 5 para Q44A y F184A; n = 6 para F298A, F427A, N449A y Q456A; n = 7 para N155A, N156A, R163A, M188A, F423A, S431A y I452A; n = 10 para W294A; n = 12 para WT y Q159A; n = 14 para T290A; n = 18 para Q83A). Los valores de p para las diferencias entre el tipo salvaje y las variantes se obtuvieron a partir de un análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de P se muestran en la figura. NS, no significativo.

Datos fuente

Para evaluar el modo de unión de la sacarosa y las funciones funcionales de los residuos en el bolsillo de unión central, se realizaron simulaciones MD con una molécula de sacarosa para identificar una posición de unión estable de la sacarosa. A modo de guía, una pose inicial para la sacarosa se basó en el homólogo estructural más cercano conocido: el simportador de melibiosa/catión MelB unido a un análogo de melibiosa que contiene galactosilo, que se propone para imitar un estado unido a sustrato (15,7 % de identidad de secuencia) (Extended Datos Fig. 10a). Realizamos diez y cinco simulaciones independientes de ~ 1 µs cada una (14,3 µs en total) en SUC1 con un Asp152 protonado (Asp152 (H)) o un Asp152 desprotonado (Asp152 (-)) y una sacarosa colocada en el MelB-inspirado pose. En todas las repeticiones, la proteína mostró un comportamiento estable (Datos extendidos Fig. 10a,b).

La mayoría de estas simulaciones no capturaron una pose fija de sacarosa estática y la sacarosa se movería libremente alrededor de la cavidad. Sin embargo, en una de las repeticiones con Asp152(H), el resto glucosilo de la sacarosa se estabilizó en una posición estática hacia el dominio N durante más de 1050 ns (datos extendidos, figura 10c). Para examinar si esta pose se parece a un evento de unión inicial estable de la molécula de sacarosa, y si esto depende de que se protone Asp152, se realizaron cinco nuevas simulaciones con Asp152(H) o Asp152(-) (10,6 µs en total) con sacarosa colocada en esta nueva posición de encuadernación (Datos ampliados Fig. 10d). En cuatro de cinco repeticiones con Asp152 (H), la sacarosa mantuvo una posición de unión estable, mientras que se liberó fácil y rápidamente en las repeticiones de Asp152 (-) (Fig. 3b y Datos extendidos Fig. 10e). Además, en las repeticiones con Asp152(H), la sacarosa volvería a la posición de unión identificada después de un evento de disociación. El mapeo de los contactos de las simulaciones independientes muestra que, en esta posición de unión estable inicial, la sacarosa interactúa específica y directamente con su resto glucosilo en Asp152 (H) y los residuos Trp47, Gly75, Asn155 y Asn156 (Fig. 3c-e y Datos extendidos Figura 10d). El análisis de contacto muestra claramente que no hay otros sitios de unión que sean remotamente comparables en escala. El mapa de contacto muestra que se forman enlaces de hidrógeno con los hidroxilos de glucosilo en las posiciones O2, O3 y O4, y esto confiere reconocimiento de sustrato. Además, las interacciones hidrofóbicas contribuyen a la unión con el glucosilo y, hasta cierto punto, también con el fructosilo inicialmente. En conjunto, las simulaciones identifican el grupo glucosilo de la sacarosa como el desencadenante del evento de unión inicial, creando selectividad inicial y, por lo tanto, sugieren que un Asp152 (H) es crucial para estabilizar la unión de la sacarosa directamente dentro del transportador.

Para probar las interacciones sugeridas por MD y probar su importancia funcional para el transporte, luego determinamos las caracterizaciones bioquímicas de los residuos propuestos y otros residuos que recubren la cavidad (Fig. 3a, d-f). Nuestros resultados confirman que los residuos predichos como centrales para la unión inicial son esenciales para el transporte. La mutación de Asn156 condujo a la pérdida completa del transporte en los ovocitos, de acuerdo con su papel destacado en la coordinación de la parte de glucosa de la sacarosa (Fig. 3f). Para el resto de glucosilo, el mapa de contacto también identificó la columna vertebral de Gly75, así como las cadenas laterales de Trp47 y Asp152 (H), lo que provocó la pérdida de la actividad de transporte cuando se muta (Fig. 2c). Para los contactos de fructosilo identificados, la mutagénesis de Asn155 tuvo poco efecto aparente sobre la actividad de transporte, lo que indica que el enlace de hidrógeno con este residuo, y cualquier interacción específica con el resto de fructosilo en la posición de unión inicial, es de menor importancia para el transporte general. Para los otros contactos identificados, la mutación de Gln159 no tuvo efecto, mientras que la mutación de Asn449 elimina el transporte (Fig. 3c, f). También nos dirigimos a los residuos en el sitio de unión identificado que estaba cerca de la unión de sacarosa, pero aún no participaba en ella (Fig. 3a). La mutación de los residuos polares Gln83 y Thr290 no tuvo efectos negativos, mientras que la mutación de los residuos polares Gln44, Ser431 y Gln456 redujo sustancialmente el transporte (Fig. 3f). Además, la mutagénesis de los residuos hidrofóbicos Phe184, Trp294, Phe298, Phe423, Phe427 o Ile452 también redujo el transporte (Fig. 3f). De interés, la mutación de Arg163 o Met188 condujo a la pérdida completa del transporte, similar a Asn449, que también se encuentra en el fondo de la cavidad, lo que indica en conjunto un papel para estos tres residuos en el estado completamente ocluido (Fig. 3f). Juntos, estos datos respaldan que la posición estable de unión a sacarosa observada en las simulaciones MD de SUC1 protonado representa un evento de unión inicial. El reconocimiento inicial del sustrato por parte de SUC1 se centra en los enlaces de hidrógeno con el resto glucosilo, mientras que otros residuos que constituyen el bolsillo de unión central tienen funciones en etapas posteriores del ciclo de transporte.

Para respaldar aún más estos resultados, probamos la especificidad del sustrato de SUC1 con una amplia gama de ligandos putativos diferentes, utilizando ensayos de ovocitos y electrofisiología basada en SSM (Fig. 4a-c). Probamos moléculas con y sin glucosilo y descubrimos que un resto de glucosilo es un activo necesario para los sustratos, mientras que el resto de fructosilo se puede sustituir más fácilmente con grupos cíclicos que tienen propiedades polares parciales (Fig. 4). Estos resultados son consistentes con el modelo de unión de que SUC1 interactúa con la unidad de glucosa de la sacarosa en la posición de unión estable inicial, y que el reconocimiento específico de la unidad de fructosa es menos importante para la actividad de transporte.

a, Especificidad de sustrato de SUC1 determinada por ensayo de competencia en ovocitos con sacarosa 1 mM y 20 veces más que los sustratos competidores a pH 5,5. Los valores de p para las diferencias entre el control (absorción de sacarosa sin competición) y la absorción de sacarosa con varios compuestos competidores se obtuvieron a partir de un ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de P se muestran en la figura. Las barras son la media ± sd Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 4 para absorción de sacarosa, sucralosa, rafinosa, sorbitol; n = 5 para todos los demás compuestos; n = 7 para ninguna proteína). b, Especificidad de sustrato de SUC1 medida a pH 5,5 mediante electrofisiología basada en SSM. Corrientes máximas provocadas por una gama de supuestos sustratos probados a 10 mM. Las corrientes máximas se normalizaron en relación con las corrientes provocadas por sacarosa después de la corrección de la señal del artefacto. Los valores de P para las respuestas actuales se obtuvieron de un ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de P se muestran en la figura. Las respuestas actuales indicadas con * diferían significativamente de la sacarosa, lo que indica que probablemente no son ligandos para el transportador, provocan corrientes pico más bajas o provocan respuestas de corriente pico más altas que la sacarosa. Las barras son la media ± sd; n = 4. Los puntos representan mediciones individuales y todas las mediciones se realizaron en un solo sensor. c, Estructuras químicas de los glucósidos utilizados para la selección de sustratos. La selección incluye monosacáridos (azul), disacáridos (verde), oligosacáridos (amarillo), alcoholes de azúcar (rosa) y otros glucósidos (naranja). pNP-α-d-glc, p-nitrofenil alfa-d-glucopiranósido; pNP-β-d-glc, p-nitrofenil beta-d-glucopiranósido.

Datos fuente

Nuestro análisis estructural, estudios funcionales y datos de simulación MD proporcionan un modelo de cómo SUC1 reconoce la sacarosa e identifican elementos estructurales clave, como el sitio de unión de protones, que se requieren para la función. El presunto aceptor/donante de protones Asp152 está estrictamente conservado en los miembros de la familia SUT/SUC (datos extendidos, figuras 1 y 6) y se ha informado anteriormente como crítico para las corrientes de transporte inducidas por sacarosa de SUC1 y para el correspondiente ortólogo de arroz OsSUT1 ( referencias 31,41). SUC1 muestra claras diferencias con otros simportadores acoplados a protones conocidos y presenta un modelo único para simportador. Primero, el acoplamiento directo entre el sitio de protones y el sitio de unión al sustrato. En segundo lugar, Gln50 en la hélice M1 que sugerimos controla el pKa de Asp152 en la hélice M4, rompiendo con el patrón genérico de usar un residuo básico para esta función como se observa en otros transportadores de protones14,35,42. Debido a estos dos factores, la unión del azúcar se vincula directamente con la unión del protón, lo que permite la liberación del azúcar en un entorno con una concentración de sacarosa muy alta, siempre que el protón se disocie. La configuración sugiere una estrecha relación de acoplamiento 1:1 entre el protón y la sacarosa, de acuerdo con los modelos cinéticos previamente informados34,43. Nuestros datos sugieren que la protonación de Asp152 es necesaria para permitir una estrecha interacción polar desde el dominio N hasta el resto glucosilo del sustrato.

Este acoplamiento estrecho y directo proporciona un eje central para explicar cómo los miembros de la familia SUT/SUC pueden operar en concentraciones extremas de sacarosa a nivel molar. La baja afinidad de SUC1 es un requisito previo para el transporte de sacarosa de alta capacidad y es evidente a partir de los desafíos para capturar un estado unido al sustrato tanto en cristalografía como en MD. Sin embargo, nuestro trabajo sugiere que el reconocimiento inicial de sacarosa está mediado por interacciones del glucosilo con el dominio N protonado. Esto está de acuerdo con hallazgos previos de que los grupos hidroxilo de glucosilo son fundamentales para el reconocimiento del sustrato44,45,46,47. También encontramos que los residuos en los dominios N y C tienen funciones importantes en el bolsillo de unión central durante el ciclo de transporte completo. La distribución de los residuos contribuyentes divide el bolsillo de unión en dos mitades: una mitad contribuye con interacciones polares, principalmente del dominio N; mientras que la segunda mitad muestra propiedades hidrofóbicas, principalmente del dominio C (Fig. 3a). Esto contrasta con el modo de unión de los transportadores de glucosa, como los transportadores de glucosa animal (GLUT) y las proteínas transportadoras de azúcar (STP) de plantas de la familia Sugar Porter. Aquí, el dominio C media en la mayoría de los contactos a través de interacciones polares con el monosacárido36,42,48,49. En los STP impulsados ​​por protones, el dominio N vincula indirectamente un sitio de protones distal con la unión de glucosa de alta afinidad en el sitio de unión central36.

En la estructura SUC1, el Arg163 perfectamente conservado en la parte inferior de la cavidad de unión tiene una función similar a la de una puerta estabilizadora al formar enlaces de hidrógeno con la columna vertebral de Phe423 (M10) y la cadena lateral de Asn181 (M5). La sustitución por una lisina no logró complementar la actividad de transporte, lo que indica un papel central de la arginina en el transporte (Datos ampliados, Figs. 6 y 7). Además, las hélices anfipáticas del EHR, estabilizadas por un puente disulfuro crítico, y la hélice anfipática del IHR son características estructurales distintas. La interrupción del IHR en los ensayos de ovocitos no tuvo ningún efecto aparente, mientras que la interrupción del EHR eliminó la actividad. Estudios previos encontraron que los agentes oxidantes aumentan la actividad del transportador, mientras que el ácido p-cloromercuribencenosulfónico, que se une covalentemente al grupo SH de las cisteínas, inhibe fuertemente la actividad del transportador5. Se ha propuesto que estas observaciones están relacionadas con la dimerización de SUC. Nuestros resultados no abordan directamente la posible dimerización, y las observaciones anteriores sobre la actividad de transporte pueden explicarse completamente por el papel clave que observamos del puente disulfuro en el EHR. Sin embargo, el papel exacto de estas regiones anfipáticas y cualquier relación con la posible dimerización sigue sin estar claro (Datos ampliados Fig. 5). La arquitectura de SUC1 también sugiere una función fisiológica de la dependencia lineal del pH y el potencial de membrana que exhibe la actividad de transporte de SUC16,34,50. Esta dependencia es diferente cuando se compara con SUC2, por ejemplo, que tiene un óptimo de pH canónico alrededor de pH 5.5 (refs. 6,51). Como SUC1 está vinculado a los tejidos del sumidero, donde se requiere un transporte rápido de sacarosa posterior al floema para controlar la fuerza del sumidero, es significativa una dependencia directa 1: 1 de la unión de protones para el transporte del sustrato. El estrecho acoplamiento de protones observado en SUC1 significa que la concentración del sustrato impulsor, la concentración de protones, está ligada linealmente a la translocación de sacarosa y permite la liberación contra un gradiente de concentración alto52. La planta puede utilizar el cambio del pH del apoplasto de manera receptiva para regular y optimizar la actividad del transportador de SUC1, que está respaldada por la baja capacidad de amortiguación pasiva del apoplasto51. La acidificación del apoplasto cuando compite con los transportadores de azúcar de patógenos invasivos aumentaría tanto la capacidad de transporte de SUC1 como la afinidad aparente, al mismo tiempo que facilitaría la reducción de la actividad del transportador de patógenos.

La familia GPH es una familia de simportadores impulsados ​​por cationes monovalentes y nuestro trabajo explica cómo se ha modificado esta arquitectura en las plantas para acomodar el transporte impulsado por protones. En las estructuras conocidas del simportador de melibiosa/Na+ bacteriano MelB y el simportador de lisofosfatidilcolina/Na+ animal MFSD2A21,53,54, los residuos en la posición equivalente a Asp152 forman parte del sitio de unión de sodio conservado, y MelB incluso muestra promiscuidad de cationes que, en parte, determina la selectividad del sustrato. La familia de transportadores de solutos humanos 45 (SLC45) también está relacionada con la familia SUT/SUC y es relevante para la síntesis de melanina y una variedad de enfermedades relacionadas. En SLC45A2, la mutación del residuo equivalente a Asp152 provoca albinismo oculocutáneo, lo que nuevamente respalda el papel crítico del aspartato en ortólogos en todos los reinos55. Además, el residuo equivalente a Arg163 juega un papel importante en la unión del sustrato en la estructura MelB unida al ligando, y su mutación en MFSD2A de mamíferos es letal, lo que demuestra una vez más el papel clave de esta posición dentro de la familia GPH54,56.

Según nuestros datos, proponemos que los SUC operan mediante un mecanismo de acceso alterno con el siguiente modelo mecánico para el reconocimiento de sustrato en el transporte (Fig. 5). En el estado abierto hacia el exterior, se abre una gran cavidad hacia el lado apoplástico que permite la entrada de sacarosa y protones. La sacarosa se asienta con el resto glucosilo anidado contra Asp152 y los residuos circundantes (Fig. 3d-e). Esta unión inicial de baja afinidad al resto glucosilo depende de la protonación de Asp152. Después de la unión de sacarosa y protones, Arg163 y otros residuos de bolsillo de unión crean más contactos de sacarosa en etapas posteriores del reconocimiento del sustrato. Esto forma un esquema de reconocimiento de dos pasos que involucra un sitio de reconocimiento de glucosilo inicial y la participación posterior de Arg163 en la translocación de sacarosa, de acuerdo con estudios previos57. Esta configuración de reconocimiento también explica la promiscuidad más amplia del sustrato hacia el sacárido secundario del sustrato. Aunque el glucosilo es relativamente invariable, el fructosilo se puede intercambiar más fácilmente (Fig. 4). Durante la transición del transportador, la red intracelular de puentes salinos se rompe, mientras que, en el lado extracelular, los residuos polares y cargados probablemente forman contactos entre las hélices para asegurar el cierre de la cavidad desde el lado apoplásico y la estabilización hacia el estado interno, como lo respaldan las previsiones. modelos y estudios de mutagénesis de ovocitos (Datos extendidos Fig. 7a,b). Después de abrirse hacia el interior, los cambios de pKa dirigidos por Gln50 conducen a la desprotonación de Asp152 para favorecer la liberación de sacarosa.

Los dominios N y C están coloreados de acuerdo con la estructura SUC1, con M1, M4, M7 y M10 resaltados como dibujos animados. La sacarosa se muestra en verde y azul y el protón se muestra como una esfera azul.

En conclusión, nuestro trabajo identifica a Asp152 como el sitio de unión de protones en la familia SUT/SUC y muestra cómo la unión de sacarosa, con el reconocimiento inicial del glucosilo, se logra mediante un acoplamiento directo a la unión de protones en este sitio. Identificamos elementos y propiedades clave de la función del transportador y explicamos un mecanismo molecular central detrás de la señalización del azúcar, las respuestas al estrés y la fuerza impulsora central detrás del movimiento vascular de la sacarosa y otros solutos en las plantas vasculares.

Se introdujo ADNc de A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) en una construcción de expresión basada en p423-GAL1 con un sitio de escisión de trombina C-terminal y una etiqueta de purificación de decahistidina. S. cerevisiae transformada (cepa DSY-5) se cultivó en un recipiente de cultivo a alta densidad mediante cultivo discontinuo alimentado y se cosechó después de una inducción de 22 h usando galactosa58. Las células recolectadas se lavaron en agua fría, se centrifugaron y se resuspendieron en tampón (Tris 100 mM, pH 7,5, NaCl 600 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1,2 mM) y luego se batieron con perlas de vidrio de 0,5 mm para lisar. El homogeneizado se centrifugó durante 20 min a 17 568 g, seguido de la sedimentación de las membranas mediante ultracentrifugación a 200 000 g durante 2 h. Las membranas celulares se homogeneizaron y se resuspendieron en tampón (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, glicerol al 20 %) antes de congelarse en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 °C. La membrana celular descongelada se solubilizó en tampón (NaCl 150 mM, Tris 50 mM pH 7,5, sacarosa al 5 % (v/v)) con n-dodecil-β-d-maltósido (DDM) al 1 % (p/v) y 0,1 % (p/v) hemisuccinato de colesterol (CHS) durante 30 min a 4 °C. El material insoluble se eliminó por centrifugación a 5.000 g durante 10 min y el sobrenadante se filtró con un filtro de 1,2 μm (PALL). El sobrenadante se complementó con imidazol 20 mM (pH 7,5) y se cargó en una columna Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) a 3 ml min−1. La columna se lavó con diez volúmenes de columna de tampón (tampón de solubilización suplementado con DDM al 0,1 %, CHS al 0,01 % e imidazol 90 mM pH 7,5) y 20 volúmenes de columna de tampón (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, 5 % (v /v) sacarosa, DDM al 0,02 % (p/v), CHS al 0,002 % (p/v) y tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 0,5 mM suplementados con imidazol 40 mM (pH 7,5). La proteína se eluyó en el mismo tampón que contenía imidazol 500 mM (pH 7,5) y las muestras de proteína eluida se agruparon, se complementaron con trombina bovina seguida de diálisis durante la noche a 4 °C en tampón (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico 20 mM (MES ) pH 6,0, NaCl 250 mM, sacarosa al 5 % (v/v), DDM al 0,02 % (p/v), CHS al 0,002 % (p/v) y TCEP 0,5 mM) usando un peso molecular de corte de 12–14 kDa ( MWCO) tubería (Spectrum). Al día siguiente, la proteína se complementó con Tris 50 mM (pH 7,5) y se cargó en una columna Ni-NTA de 5 ml (GE Healthcare) para eliminar la etiqueta de purificación y los contaminantes. La proteína se recogió con tampón (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, sacarosa al 5 % (v/v), DDM al 0,02 % (p/v), CHS al 0,002 % (p/v) y TCEP 0,5 mM) suplementado con 40 imidazol mM (pH 7,5), concentrado utilizando una columna giratoria MWCO de 50 kDa (Vivaspin) y sometido a columna Superdex 200 Increment 10/300 GL (GE Healthcare) en tampón (MES 20 mM pH 6,0, NaCl 250 mM, 5 % (v /v) sacarosa, 0,02 % (p/v) de DDM, 0,002 % (p/v) de CHS y 0,5 mM de TCEP). La composición del tampón de exclusión por tamaño se optimizó para la estabilidad de la muestra59. Las fracciones máximas se agruparon y la proteína se concentró a 14 mg ml-1 utilizando una columna giratoria MWCO de 50 kDa (Vivaspin).

SUC1 se cristalizó en la fase cúbica lipídica. La proteína purificada se mezcló con monooleína (Sigma) en una proporción de proteína a lípido de 1:1,5 utilizando un mezclador de jeringa. Para la cristalización, se mezclaron 50 nl de la fase meso con 1000 nl de tampón de cristalización que contenía polietilenglicol 400 al 43,5 % (v/v), dihidrógeno fosfato de amonio 0,25 M y bis-tris propano 0,15 M (pH 6,3) en placas sándwich de vidrio utilizando un robot Gryphon (Art Robbins Instruments). Los cristales de fase cúbica lipídica aparecieron después de 1 a 2 días y crecieron hasta su tamaño completo de 100 × 10 × 30 µm a 19 °C en 1 semana. Los cristales se recolectaron utilizando Dual Thickness MicroMounts LD (MiTeGen) y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Después de una extensa selección, el conjunto de datos final se recopiló en la línea de luz de microfoco I24 de Diamond Light Source utilizando un haz de 20 × 20 µm. Un solo cristal se difractó 360° con un ángulo de oscilación de 0,10° con rayos X de longitud de onda de 1,0 Å. El conjunto de datos se procesó y escaló usando DIALS60 y AIMLESS61 a través de la tubería XIA262 en el grupo espacial triclínico P1 (grupo de puntos 1), lo que sugirió la presencia de dos moléculas SUC1 en la unidad asimétrica con un contenido de solvente de ~56 %. En un intento por resolver el problema de la fase, se utilizaron 65 modelos de búsqueda generados a partir de estructuras conocidas de miembros de MFS para el reemplazo molecular. Sin embargo, no se pudo obtener ninguna solución adecuada para la solución estructural. El problema de la fase se resolvió mediante el reemplazo molecular utilizando PHASER63 con un modelo RoseTTAFold-predicted64 SUC1; Las estimaciones rmsd del modelo se convirtieron en factores B antes de las modificaciones finales del modelo de búsqueda utilizando SCULPTOR65. Esta búsqueda dio una solución con una puntuación Z de la función de traducción de 9 y una puntuación de ganancia de probabilidad logarítmica de 259 con un límite de resolución de 3,5 Å, con dos moléculas en la unidad asimétrica formando un dímero no fisiológico con un cálculo inicial de Rlibre del 52 %. en Refmac66. Se realizó un refinamiento inicial con Refmac y modificación de la densidad con coincidencia de histogramas, aplanamiento de solventes y corrección de anisotropía para reducir el sesgo del modelo de búsqueda con Parrot67 en la suite CCP468. El mapa de densidad de electrones permitió la construcción de modelos iterativos en Coot69 y el refinamiento usando phenix.refine usando mapas 2mFO-DFc y generó mapas mejorados de características70 usando fases de modelo. Realizamos el refinamiento final en phenix.refine con una estrategia de refinamiento de sitios individuales, parámetros de desplazamiento atómico (ADP) individuales y grupo de traducción-libración-tornillo (nueve grupos) y restricciones de simetría no cristalográfica contra un objetivo de máxima probabilidad con reflejos en los 35 Rango de resolución de –2,68 Å. El modelo final arrojó un factor R libre (Rfree) de 29,30 % y un factor R (Rwork) de 26,96 % (Tabla complementaria 1). La evaluación MolProbity71 de la gráfica de Ramachandran dio un 98,31 % de regiones favorecidas y un 0,13 % de valores atípicos. Las figuras se prepararon utilizando ChimeraX v.1.4 (ref. 72). Las alineaciones de secuencias se construyeron con PROMALS3D73. Las alineaciones se visualizaron usando ALINE v.1.0.025 (ref. 74). La conservación de la secuencia evolutiva se analizó utilizando ConSurf75. El potencial electrostático coulombiano se calculó en ChimeraX v.1.4 (ref. 72).

El extracto de lípidos polares de soja (composición (p/p), fosfatidilcolina al 45,7 %, fosfatidiletanolamina al 22,1 %, fosfatidilinositol al 18,4 %, ácido fosfatídico al 6,9 % y otros lípidos de soja al 6,9 %) en cloroformo (Avanti) se secó y resuspendió en tampón de reconstitución (30 mM). HEPES pH 7,4, NaCl 140 mM y MgCl2 5 mM). Los liposomas se homogeneizaron mediante extrusión a través de membranas de policarbonato con un tamaño de poro de 0,4 µm (Millipore) y se añadió n-octil-β-d-glucósido (Anatrace) hasta una concentración final del 1% (v/v). La suspensión de liposomas se sonicó en un baño de agua tres veces durante 1 min, con incubación en hielo durante 1 min entre cada sonicación. La proteína purificada se añadió a los liposomas hasta una proporción calculada de lípido:proteína de cinco. El detergente n-octil-β-d-glucósido se eliminó incubando con 400 mg ml-1 de Bio Beads (Bio-Rad) durante la noche a 4 °C usando un agitador rotatorio. Los proteoliposomas (5 mg ml-1) se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C.

La electrofisiología basada en SSM se realizó en un SURFE2R N1 (Nanion Technologies). Para todos los experimentos, la preparación de los sensores se realizó como se describe76. Los proteoliposomas se diluyeron 1:5 en tampón no activador, se sonicaron tres veces durante 10 s en un baño de agua y se aplicaron a sensores de 3 mm, seguido de centrifugación a 2100 g durante 30 min a 4 °C. Para los ensayos de titulación de azúcar, tanto el tampón activador como el no activador se prepararon a partir del mismo tampón principal (mgCl2 5 mM y tampón de fosfato de potasio 100 mM a un valor de pH dado). El tampón no activador se complementó con manitol 810 mM, una molécula relacionada estructuralmente que no es transportada por SUC1. El tampón activador se preparó de manera equimolar añadiendo sacarosa 810 mM, seguido de dilución en tampón no activador para mantener la osmolaridad constante para todas las soluciones utilizadas durante un experimento. Se utilizó un único flujo de trabajo de intercambio de solución. Los puntos de datos representan la media de tres mediciones independientes. Para las mediciones de la especificidad del sustrato, se prepararon tampones activador y no activador a partir del tampón principal pH 5,5, conteniendo el tampón activador 10 mM del sustrato de interés. El ensayo se realizó en membranas de muestra y de control negativo para distinguir las corrientes que se originan en SUC1 y las corrientes de artefactos inducidas por los diferentes componentes que interactúan con el SSM. Para determinar las corrientes de transporte SUC1 para cada sustrato individual, a las corrientes medidas para un sustrato dado se les restó el valor promedio del control negativo correspondiente. Los datos representan la media de tres mediciones independientes realizadas en un solo sensor y se normalizaron según las mediciones de sacarosa. Para la medición en condiciones de pH simétrico, se utilizó una configuración de intercambio de solución única. La muestra se incubó a un pH dado durante 6 min entre mediciones a diferentes valores de pH para ajustar el pH interno de los proteoliposomas al pH externo. Las corrientes máximas se midieron tras la adición de tampón activador al pH dado que contenía sacarosa 10 mM. Para cada sensor, después de las mediciones a diferentes valores de pH, se volvió a medir la señal del sensor al pH neutro inicial para evaluar la posible pérdida de señal durante la titulación de pH, por ejemplo, causada por la disminución de la estabilidad de la proteína a diferentes pH. Estas amplitudes de señal fueron comparables a las mediciones iniciales, lo que demuestra que la actividad del transportador se mantuvo durante todo el experimento. Los experimentos se realizaron al menos por triplicado y los datos se analizaron con GraphPad Prism v.9. El ajuste de Michaelis-Menten se utilizó para el análisis de ajuste de curvas y la determinación de Km. Las barras de error representan la sd Como la señal de corriente máxima puede ser un efecto combinado de eventos electrogénicos de unión, transporte y protección o neutralización de corrientes, usamos el parámetro Kmapp solo para el transporte de sacarosa en todo el manuscrito, que alternativamente también puede describirse como el la mitad de la concentración efectiva máxima. En symport tenemos más de un sustrato, en este caso sacarosa y H+. Para cualquier caso de dos sustratos, el valor de Km para un sustrato se determina, en principio, por extrapolación a concentraciones infinitas del segundo sustrato. Por lo tanto, usamos 'app' en Kmapp para enfatizar que los valores de Km determinados para la sacarosa se aplican específicamente al pH definido.

El ADNc de A. thaliana SUC1 (UniProt: Q39232) se clonó en el vector pNB1-U 77 y la variante de fusión GFP del vector que alberga un enlazador de glicina-serina de diez residuos C-terminal seguido de la secuencia del gen que codifica eGFP. Todas las mutaciones se crearon usando mutagénesis dirigida al sitio con una polimerasa Q5 (New England Biolabs). Para la preparación de ADNc, los genes se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores estándar con regiones no traducidas en 5′ y 3′ (hacia adelante, TTAACCCTCACTAAAGGGTTGTAATACGACTCACTATAGGG; hacia atrás, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATACTCAAGCTAGCCTCGAG) seguido de purificación por PCR (GeneJET PCR Purification, Thermo Fisher) después de la separación en gel de agarosa al 1 %. El ARN se sintetizó mediante transcripción in vitro utilizando el kit de transcripción mMESSAGE mMACHINE T7 (Thermo Fisher). Se fabricaron agujas capilares para la inyección de ARN utilizando un extractor de micropipetas PC-10 (Narishige). Para la expresión, se inyectaron 25 ng de ARN a cada uno de los ovocitos de Xenopus laevis (EcoCyte Bioscence) utilizando el Nanoject III (Drummond Scientific), seguido de una incubación a 16 °C durante 3 días en tampón ND-96 (NaCl 96 mM, MgCl2 1 mM , KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, HEPES 5 mM pH 7,4) con 10 UI ml−1 de gentamicina (Invitrogen). Para los ensayos de absorción dependientes de la concentración, se utilizaron concentraciones de sacarosa que oscilaban entre 0,1 y 20 mM en tampón de reacción ND-96 (NaCl 96 mM, MgCl2 1 mM, KCl 2 mM, CaCl2 1,8 mM, MES 5 mM pH 5,5) y [14C Se añadió sacarosa (PerkinElmer) a cada solución de azúcar a una concentración de 1 μCi ml−1. Antes de los ensayos de captación, los ovocitos se lavaron y preincubaron durante 5 min en tampón de reacción. Para el ensayo de captación, los ovocitos se incubaron en el tampón de reacción a una concentración de sacarosa determinada durante 30 min. Todos los ensayos se realizaron a pH 5,5 a menos que se indique específicamente. La reacción se detuvo mediante la adición de tampón de reacción enfriado con hielo complementado con sacarosa 100 mM seguido inmediatamente por el lavado de los ovocitos en tampón de reacción enfriado con hielo. Para los controles, los ovocitos inyectados con agua pura en lugar de ARN se incubaron de manera similar. En los ensayos de competición, el tampón de reacción estaba compuesto por 1 μCi ml−1 de [14C]sacarosa, 0,5 mM de sacarosa y una concentración 20 veces superior del azúcar competidor (10 mM). Para el ensayo de actividad de captación de mutantes y ensayos de captación dependientes del pH, el tampón de reacción estaba compuesto por 1 μCi ml−1 de [14C]sacarosa y sacarosa 1 mM. Para los ensayos dependientes del pH, el tampón de reacción se complementó con fosfato de potasio 50 mM ajustado al pH deseado, o citrato 25 mM ajustado a pH 3,5, 4,5 o 5,5 en ensayos dependientes del pH de mutantes. Para los ensayos de absorción dependientes del tiempo, se utilizó una concentración de sacarosa 675 μM (Sigma-Aldrich) y se añadió [14C]sacarosa hasta una concentración final de 1 μCi ml−1. Cada ovocito fue tratado como un solo experimento. Los ovocitos se transfirieron individualmente a un vial de centelleo y se rompieron mediante la adición de 100 μl de una solución de SDS al 10 % seguido de agitación vorticial inmediata. Se añadió un volumen de 3 ml de líquido de centelleo OptiPhase HiSafe 3 (PerkinElmer) a cada muestra y se cuantificó la radiactividad utilizando un contador de centelleo líquido Tri-Carb 4910TR (PerkinElmer). Los experimentos se realizaron al menos por triplicado y los datos se analizaron utilizando GraphPad Prism v.9. El ajuste de Michaelis-Menten se utilizó para el análisis de ajuste de curvas y la determinación de Km. Las barras de error representan la sd Para determinar si la localización de la proteína se vio afectada por la mutagénesis puntual, se analizó la localización celular en mutantes y tipos salvajes fusionados con eGFP C-terminal mediante microscopía de barrido láser confocal. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio de escaneo láser confocal Zeiss LSM 780 Axio Imager 2 con el software operativo ZEN v.3.5. Utilizamos el objetivo 10x con una longitud de onda de excitación de 488 nm utilizando una potencia de láser del 2,55 % con un tiempo de cuadro de 7,75 s, mostrando un cuarto de un corte óptico de un ovocito de 3 días después de la inyección. Debido a que tenemos más de un sustrato en simport, los valores de Kmapp se usaron como se explica en los ensayos de electrofisiología basados ​​en SSM.

El modelo predicho de RoseTTAFold, que usamos para la fase de reemplazo molecular, y el modelo predicho de AlphaFold v.2, muestran una conformación abierta hacia afuera con rmsd de átomos de Cɑ en la estructura experimental entre 1,6 y 2,5 Å. Por lo tanto, los modelos predichos por IA son bastante precisos, al menos para las partes centrales de la estructura. Para identificar los residuos que podrían ser responsables de afectar el pKa de Asp152 al estado de protonación directa, utilizamos AlphaFold v.2 (ref. 39) para muestrear conformaciones alternativas de SUC1. Esto se hizo reduciendo la profundidad de la alineación de secuencias múltiples de entrada (MSA)40 y modificando la secuencia de la proteína de entrada SUC1 introduciendo mutaciones de alanina en Arg99, Arg100 y Arg357, que son residuos de la red intracelular de la red de puentes salinos entre dominios que estabiliza SUC1 en la conformación abierta hacia afuera. Las ejecuciones de predicción se ejecutaron utilizando AlphaFold v.2.0.1 a través del servidor ColabFold utilizando AlphaFold2_advanced notebook78. Todos los MSA se obtuvieron utilizando el servidor MMSeqs279 y max_msa_clusters se redujo a 32 grupos de secuencias elegidos al azar y max_extra_msa se redujo a 64 secuencias adicionales que se usaron para calcular estadísticas de resumen adicionales. Todos los modelos pronosticados se sometieron a Amber-Relax después de su predicción.

La cadena A de la estructura cristalina de SUC1 se procesó inicialmente con Maestro v.13.0. Los estados de protonación de los residuos ionizables se determinaron utilizando PROPKA80, donde el lado apoplástico del transportador estaba a pH 5 y el lado citoplasmático estaba a pH 7. Los enlaces de hidrógeno se optimizaron al considerar la elección de los tautómeros. Asp304 (pKa 7,47) se modeló como protonado; His65 (pKa 6,19), His205 (pKa 5,90) e His390 (pKa 6,25) se expusieron al medio apoplástico y, por lo tanto, se protonaron tanto en Nδ como en Nε del anillo de imidazol. His89 (pKa 6,14) se enfrentó al citoplasma y se protonó solo en Nε. Asp152 (pKa 6.50), ubicado en la cavidad central, se consideró tanto en un estado protonado (Asp152 (H)) como desprotonado (Asp152 (-)). El puente disulfuro observado se modeló entre Cys216 y Cys220.

SUC1 se alineó con el eje z y se colocó en una caja cúbica (90 × 90 × 118 Å3) y se rodeó de 188 lípidos de 1-palmitoil-2-oleoil-glicero-3-fosfocolina en un plano x-y. El sistema proteína-membrana se solvató en potencial intermolecular transferible con agua de 3 puntos (TIP3P)81 y NaCl 150 mM que neutraliza la carga.

Se accedió a las coordenadas iniciales de sacarosa a través del Banco de datos de proteínas del Colaboratorio de investigación para la bioinformática estructural (identificador químico PRD_900003). Para explorar el paisaje conformacional, se colocó una sola molécula de sacarosa en una caja de dodecaedro, se solvató con agua TIP3P81 y NaCl 0,15 M y se simuló usando el campo de fuerza CHARMM36m82 en tres repeticiones y durante 1 μs cada una.

Las posturas conformacionales de la sacarosa resultantes de estas simulaciones se agruparon utilizando el algoritmo gromos83 implementado en la suite de análisis Gromacs84 con un valor de corte de agrupamiento de 4 Å. La estructura intermedia del grupo más grande, que consta de la mitad de todos los marcos de simulación, se tomó como una pose de sacarosa representativa. La colocación de esta pose de sacarosa en la cavidad central de SUC1 fue informada por un homólogo bacteriano melibiosa permeasa MelB (PDB: 7L17 que se cocristalizó con 4-nitrofenil α-d-galactopiranósido54. Primero, las estructuras MelB y SUC1 se alinearon en función de las posiciones de átomos de Cα de la columna vertebral. A continuación, los carbonos del anillo del resto glucosilo de la sacarosa se alinearon con los carbonos del anillo de la galactosa presente en la estructura MelB. SUC1 se modeló con dos estados de protonación de Asp152: Asp152 (-), lo que resultó en una cadena lateral cargada negativamente , y el estado Asp152 (H) (descargado). Las simulaciones para ambos sistemas se iniciaron con esta pose de sacarosa idéntica inspirada en MelB (Datos extendidos Fig. 10a). Después de ~ 14 μs de simulaciones, la simulación que exhibió la unión más estable del sustrato (datos extendidos Fig. 10c), se usó la repetición 2 de Asp152 (H) para extraer una posición estable de unión a sacarosa en la cavidad central de SUC 1. La trayectoria de simulación se alineó con los átomos Cα iniciales del esqueleto de la proteína, se usó el algoritmo de agrupamiento de gromos83 en los valores rmsd de los átomos pesados ​​de sacarosa con un valor de corte de 3,8 Å y se usó la estructura intermedia del cúmulo más grande (representativo del 78 % de los fotogramas de la trayectoria) como conformación de la unión estable de sacarosa posar en SUC1. Ahora se inició una segunda ronda de simulaciones desde la pose de sacarosa estable identificada y bajo las dos condiciones de protonación de Asp152 (Datos extendidos Fig. 10a).

Todas las simulaciones se realizaron con el campo de fuerza CHARMM36m82 y en el software de simulación Gromacs 202084. Inicialmente, los sistemas se minimizaron utilizando el algoritmo de descenso más pronunciado hasta que las fuerzas convergieron o alcanzaron un valor máximo de 500 kJ mol-1 nm-1. La temperatura se fijó en 296 K para reflejar las condiciones de crecimiento de A. thaliana. La temperatura se reguló utilizando el termostato Berendsen85 durante la etapa de equilibrio y un termostato de cambio de escala de velocidad86 durante la producción, con el acoplamiento de temperatura aplicado en tres grupos: proteína con el sustrato, membrana y solvente. Para las simulaciones solo con sacarosa, solo había dos grupos acoplados: sacarosa y solvente. La presión de 1 atm se mantuvo utilizando el barostato de Berendsen85 durante los equilibrios y el barostato de Parrinello-Rahman87 durante las corridas de producción. Todas las simulaciones que contenían una membrana tenían un tipo de acoplamiento de presión semiisotrópico, mientras que las simulaciones solo con sacarosa se simularon de manera isotrópica. Durante las corridas de producción, el paso de integración del algoritmo de salto se estableció en 2 fs, mientras que el algoritmo de restricción LINCS88 se aplicó a todos los enlaces asociados con los átomos de hidrógeno en el sistema. El cálculo de las interacciones electrostáticas de largo alcance se realizó utilizando el método Ewald de malla de partículas89,90, con un límite de 1,2 nm para las interacciones en el espacio real. El valor de corte para las interacciones de Van der Waals se estableció en 1,2 nm, con un modificador de cambio de fuerza aplicado a 1,0 nm. Todos los sistemas se equilibraron utilizando el protocolo CHARMM-GUI estándar y con restricciones de posición gradualmente decrecientes, a partir de 4000 kJ mol-1 nm-2 para los átomos de la columna vertebral y los átomos del anillo de sacarosa; 2000 kJ mol-1 nm-2 para los átomos de la cadena lateral de la proteína y los átomos pesados ​​de sacarosa restantes; y 1000 kJ mol-1 nm-2 para el átomo de fósforo de cada lípido, los ángulos diédricos seleccionados del resto de glicerol y el segmento de doble enlace de la cola lipídica. Los equilibrios se ejecutaron durante 250 ps en un conjunto canónico (NVT), seguidos de 1,75 ns de equilibrios de conjunto isotérmico-isobárico (NPT). Las corridas de producción para SUC1 en membrana se realizaron sin restricciones de posición, en repeticiones de cinco o diez y hasta una escala de tiempo de microsegundos (Datos extendidos Fig. 10c).

La rmsd para los átomos de proteína Cα se calculó en Gromacs84 frente a la estructura cristalina SUC1 de referencia. El valor rmsd para la sacarosa se comparó con la pose de sacarosa estable como referencia. Si una pose de sacarosa tenía un valor rmsd inferior o igual a 3 Å, el sustrato se consideraba unido, mientras que los valores rmsd más altos indicaban que la pose no estaba unida. Las interacciones proteína-sacarosa se evaluaron utilizando el software ProLIF91, en el que los enlaces de hidrógeno se definen como interacciones entre un donante y un aceptor que involucra un hidrógeno, dentro de la distancia de 3,5 Å y formando un ángulo entre 130 y 180°. Las interacciones hidrofóbicas son entre átomos no polares colocados a una distancia inferior o igual a 4,5 Å. Los mapas de contacto promediados para los sistemas Asp152(H) y Asp152(−) se generaron considerando fotogramas de todas las simulaciones a partir de una pose de sacarosa estable, calculando la frecuencia de cada interacción en todos los fotogramas y visualizando solo las interacciones que ocurren durante al menos 25 % del tiempo total de simulación.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

El modelo atómico y los factores de estructura se depositaron en el Protein Data Bank (PDB: 8BB6). Las coordenadas de MelB utilizadas para asignar la posición inicial de sacarosa para MD se pueden descargar del Protein Data Bank (PDB:7L17). La secuencia de la proteína SUC1 para A. thaliana utilizada en este estudio está disponible públicamente en UniProt (https://www.uniprot.org/) (UniProt: Q39232). Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Damos las gracias a D. Stokes y U. Hammes por sus comentarios sobre el manuscrito. Reconocemos las líneas de luz I24 e I04 en Diamond Light Source y la línea de luz BioMAX en el Laboratorio MAX IV, donde se recopilaron datos de rayos X, y DESY-PETRA III para la detección de cristales. Los cálculos MD se realizaron en el grupo Grendel-S del Centro de Computación Científica Aarhus. También agradecemos a M. Nadzieja (Biología Molecular de Plantas, Departamento de Biología Molecular y Genética, Universidad de Aarhus) por la instrucción en microscopía láser confocal. Los cálculos MD fueron posibles gracias a subvenciones de la Fundación Novo Nordisk (NNF18OC0032608 y NF20OC0065431) y la Fundación Lundbeck (R346-2020-1944) a BS. Este proyecto recibió financiación del Consejo Europeo de Investigación en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea ( convenio de subvención n° 101000936) a BPP

Departamento de Biología Molecular y Genética, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Laust Bavnhøj, Jan Heiner Driller y Bjørn Panyella Pedersen

Departamento de Química, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Lorena Zuzic, Amanda Dyrholm Stange y Birgit Schiøtt

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LB contribuido a la preparación de muestras. LB y BPP contribuyeron a la recopilación y el análisis de datos estructurales. LB y JHD contribuyeron a los ensayos de actividad. LZ, ADS y BS contribuyeron a las simulaciones MD.

Correspondencia a Bjørn Panyella Pedersen.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Plants agradece a John Ward y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Alineación entre A. thaliana SUC1 (número de acceso Q39232), SUC2 (número de acceso Q39231), SUC3 (número de acceso O80605), SUC4 (número de acceso Q9FE59), SUC5 (número de acceso Q9C8X2), SUC6 (número de acceso Q6A329), SUC7 (número de acceso número Q67YF8), SUC8 (número de acceso Q9ZVK6), SUC9 (número de acceso Q9FG00). Los residuos conservados se destacan con escala de grises, donde el negro se conserva perfectamente. Los tubos de colores representan hélices α que se encuentran en el dominio N (cian), EHR e IHR (gris) y el dominio C (naranja). Los residuos clave están numerados encima de las marcas de hélice α. Los residuos clave están resaltados en verde, excepto el par donante/aceptor de protones en rojo (Asp152) y azul (Gln50). Las cisteínas que forman el puente disulfuro entre EHR y M6 están resaltadas en amarillo. Los motivos A que denotan la superfamilia MFS están resaltados en azul claro. El sitio de fosforilación postraduccional en el N-terminal92 es de color magenta claro. La mutación de este residuo de sitio (Ser20) a alanina en SUC1 no afectó la absorción en los ovocitos en comparación con el tipo salvaje (Datos extendidos, Fig. 7b).

a, Perfil de cromatografía de exclusión por tamaño de SUC1 y gel SDS-PAGE representativo de proteína SUC1 purificada. Los experimentos independientes se han repetido tres veces con resultados similares. b, Foto de luz polarizada y foto de campo brillante de cristales SUC1 en configuración de fase cúbica lipídica. Los experimentos independientes se han repetido tres veces con resultados similares. c, Unidad asimétrica y empaquetamiento de cristal de SUC1. d, La columna vertebral de SUC1 coloreada por el factor de desplazamiento atómico (factor B) con un gradiente de arco iris de bajo/azul (29,91 Å2) a alto/rojo (103,48 Å2) con una media de 47,10 Å2.

a, Captación de sacarosa en ovocitos que expresan SUC1 (círculos negros) y ovocitos inyectados con agua (círculos vacíos) a una concentración externa inicial de sacarosa 1 mM a pH 5,5. Los puntos de datos son la media ± sd; n = 4 ovocitos y cada uno de los ovocitos representa mediciones individuales. b, el ensayo de captación de ovocitos muestra una dependencia clásica del pH que se escala linealmente con la concentración de protones externos en el rango viable de la configuración experimental. El transporte se midió a pH 3,5-9,5 en tampón de fosfato. Todas las medidas se realizaron en presencia de sacarosa 1 mM. Las barras son la media ± sd; Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 4 (pH 3,5, 4,5, 5,5), n = 5 (pH 8,5, 9,5), n = 6 (pH 6,5, 7,5). c, Corrientes máximas usando electrofisiología SSM para el SUC1 WT proteoliposomas provocados por la adición de sacarosa 10 mM al pH simétrico indicado (pHin = pHout) Las barras son la media ± sd yn = 4. Los puntos son mediciones individuales.

Datos fuente

Densidad ponderada de 2mFo-DFc a 1σ de la estructura abierta externa de SUC1 (monómero, cadena A) con los elementos del modelo final superpuestos, incluidos M1 a M12, hélice EHR, puente disulfuro C216-C220, hélice IHR y modelo completo mostrado como regaliz con aguas ( puntos rojos) incluidos.

a, Vistas laterales de la estructura SUC1 con potencial de lipofilia molecular (MLP) que se muestra como superficie molecular y coloreada de cian oscuro (más hidrofílico) a vara de oro oscuro (más lipofílico). Los recuadros resaltan las regiones helicoidales en las hojuelas de la membrana plasmática. Los límites de la membrana (folleto exterior; azul, folleto interior; rojo) se calcularon utilizando el servidor web PPM93. b, Región helicoidal intracelular anfipática (IHR) mostrada como caricatura con residuos etiquetados como barras (izquierda) coloreadas según la lipofilicidad como en el panel A y diagrama de proyección de la rueda de Edmundson de los residuos de la región helicoidal con residuos hidrofóbicos mirando hacia el interior de la membrana plasmática y residuos polares frente al citoplasma (derecha). c, Región helicoidal extracelular anfipática (EHR) mostrada como caricatura y residuos etiquetados como barras (izquierda) coloreadas de acuerdo con la lipofilicidad como en el panel A y diagrama de proyección de la rueda de Edmundson de los residuos de la región helicoidal con residuos hidrofóbicos mirando hacia la hoja externa de la membrana plasmática y residuos polares frente al apoplasto. d, ensayo de captación de ovocitos para mutantes SUC1 dirigidos al IHR. Las actividades de captación se normalizan a las del tipo salvaje. El control son ovocitos inyectados con agua. Las barras son la media ± sd Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 6 (I272S/F273S,E271A,F276S), n = 7 (L268S/F269S), n = 11 (L268S/F269S/I272S/F273S/F276S), n = 16 (WT)). Los valores de p para las diferencias entre el tipo salvaje y las variantes se obtuvieron de un análisis ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (p = 0,9145 (L268S/F269S/I272S/F273S/F278S), p = 0,2915 (I272S/F273S), p = 0,8544 (F276S), p = 0,6264 (E271A)). e, Ensayo de captación de ovocitos para mutantes SUC1 dirigidos al EHR. Las actividades de captación se normalizan a las del tipo salvaje. El control son ovocitos inyectados con agua. Las barras son la media ± sd Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 3 (L204S/M207S, F208S), n = 6 (L204A/M207A/F208A), n = 7 (C216A), n = 16 (WT)). Los valores de p para las diferencias entre el tipo salvaje y las variantes procedían de un análisis ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (p = 0,4290 (L204A/M207A/F208A)).

Datos fuente

Conservación de los residuos en SUC1 (mostrado como caricatura) entre secuencias SUC (con 35–95 % de secuencia ID a SUC1) a través de especies de plantas según lo obtenido por ConSurf. Los residuos (que se muestran como barras) están coloreados desde variable (cian) hasta completamente conservado (magenta).

a, Residuos cargados extracelulares e intracelulares con residuos etiquetados involucrados en la formación de puentes salinos (fuente negra) o enlaces de hidrógeno (fuente gris) en la estructura cristalina abierta hacia el exterior de SUC1 y en el estado abierto hacia el interior de SUC1 predicho por AlphaFold2. Los guiones amarillos indican enlaces de hidrógeno (Límites de distancia y ángulo para enlaces de hidrógeno según lo definido por la configuración predeterminada en chimeraX v1.4). b, Ensayo de captación de ovocitos para mutantes SUC1 dirigidos a los enlaces de hidrógeno y las redes de puentes salinos observadas en la estructura (red intracelular) o prevista (red extracelular prevista), así como el sitio de fosforilación de SUC1 en Ser20 (sitio P). Las actividades de captación se normalizan a las del tipo salvaje. Las barras son la media ± sd Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 5 (D304N), n = 6 (D123N, R139A), n = 7 (H65K, D91N, R163K, D306N, E353Q), n = 10 (S20A), n = 13 (Peso)). Los valores de p para las diferencias entre el tipo salvaje y las variantes procedían de un análisis ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett (p = 0,1624 (S20A), p = 0,9729 (H65K)). Los colores corresponden a la posición del residuo en la Fig. 1e. c, predicción AlphaFold2 del modelo abierto hacia adentro de SUC1 (gris) superpuesto a la estructura cristalina abierta hacia afuera de SUC1 determinada experimentalmente (cian). Los guiones amarillos indican enlaces de hidrógeno y la flecha gris indica el movimiento principal de la hélice M1 con Gln50 (Límites de corte de distancia y ángulo para enlaces H según lo definido por la configuración predeterminada en chimeraX v1.4).

Datos fuente

a, Ensayo de captación de ovocitos sin o con adición de CCCP 20 veces mayor (20 mM) (gris claro) a pH 5,5. Los ovocitos inyectados con agua (sin proteína) sirvieron como control para la captación. Los valores de p para las diferencias entre el control (absorción de sacarosa) y sin proteína y CCP fueron de un análisis ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. Los valores de P se muestran en la figura. Las barras son la media ± sd; Los puntos de datos son experimentos individuales (n = 4 (absorción de sacarosa), n = 5 (CCCP), n = 7 (sin proteína)). b, Corrientes máximas determinadas por electrofisiología SSM en proteoliposomas SUC1 a valores de pH simétricos como se indica. El transporte se describió mediante la cinética de Michaelis-Menten realizando un análisis de ajuste no lineal. Los círculos grises muestran las corrientes máximas de un sensor preparado con liposomas vacíos de proteínas. Los puntos de datos son la media ± sd (n = 3 experimentos biológicamente independientes).

Datos fuente

SUC1 y los mutantes correspondientes que albergan una GFP C-terminal muestran una localización similar a la membrana plasmática de los ovocitos de Xenopus laevis. Los experimentos independientes se han repetido dos veces con resultados similares.

a, Diagrama de flujo del análisis MD. b, seguimiento de la red troncal rmsd Cα en el transcurso de todas las simulaciones MD. Todas las corridas se compararon con la estructura cristalina. c, Comparación del curso temporal de rmsd de sacarosa a partir de simulaciones iniciales realizadas con sacarosa en la pose inicial "inspirada en MelB", con Asp152 protonado (Asp152 (H)) o desprotonado (Asp152 (-)). La unión estable de sacarosa a SUC1 se indica con un fondo azul oscuro. d, Mapas de contacto entre los átomos de sacarosa y los residuos de SUC1 en las cinco repeticiones ejecutadas con sacarosa comenzando en la posición estable identificada. Los contactos calculados entre átomos están definidos por los criterios de interacción proporcionados por el software ProLIF91. Solo se consideran las interacciones que ocurren en al menos el 25% de los marcos e incluyen interacciones de enlaces de hidrógeno (azul) e interacciones hidrofóbicas (rojo). e, Comparación del curso temporal de rmsd de sacarosa a partir de simulaciones realizadas con sacarosa en la posición inicial estable identificada, también mostrada como una aguja/alfiler con cabeza que representa el resto glucosilo, con dos estados de protonación diferentes de Asp152: Asp152(H) y Asp152 (-) en cinco repeticiones independientes, respectivamente. El fondo del gráfico rmsd indica la posición unida (azul oscuro) o no unida (azul claro) de la sacarosa.

Tabla complementaria 1. Estadísticas de recopilación y refinamiento de datos.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto. Electrofisiología SSM, corrientes de pico.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto. Electrofisiología SSM, corrientes de pico.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto. Electrofisiología SSM, corrientes de pico.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto. Electrofisiología SSM, corrientes de pico.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto.

Ensayo de captación, recuentos brutos por minuto. Electrofisiología SSM, corrientes de pico.

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Reimpresiones y permisos

Bavnhøj, L., Driller, JH, Zuzic, L. et al. Estructura y mecanismo de unión a sacarosa del transportador de sacarosa SUC1 de la planta. Nat. Plantas (2023). https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Recibido: 21 noviembre 2022

Aceptado: 19 de abril de 2023

Publicado: 15 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41477-023-01421-0

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Plantas naturales (2023)