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Jan 07, 2024

La unión del sustrato en el transportador ADP/ATP mitocondrial es un paso

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3585 (2022) Citar este artículo

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Los transportadores mitocondriales de ADP/ATP importan ADP a la matriz mitocondrial y exportan ATP al citosol para alimentar los procesos celulares. Las estructuras de los estados abiertos de matriz y citoplasmático inhibidos han confirmado un mecanismo de transporte de acceso alterno, pero los detalles moleculares de la unión al sustrato siguen sin resolverse. Aquí, evaluamos el papel de los residuos expuestos al solvente de la ruta de translocación en el proceso de unión al sustrato. Identificamos el sitio de unión principal, que comprende tres residuos cargados positivamente y un conjunto de residuos alifáticos y aromáticos, que unen ADP y ATP en ambos estados. Además, hay dos pares de residuos de asparagina/arginina en lados opuestos de este sitio que están involucrados en la unión del sustrato de una manera dependiente del estado. Así, los sustratos se dirigen a través de una serie de poses de unión, induciendo los cambios conformacionales del portador que conducen a su translocación. Las propiedades de este sitio explican la naturaleza electrogénica y reversible del transporte de nucleótidos de adenina.

La viabilidad y la función de las células eucariotas se basan en el transporte de metabolitos e iones a través de la membrana interna mitocondrial impermeable para sostener las vías metabólicas de la mitocondria y el citosol y proporcionar compuestos para el mantenimiento celular y organelar. La mayoría de estos compuestos son transportados por la familia de transportadores mitocondriales (SLC25), que es la familia de transportadores de solutos más grande en humanos1,2,3. El transportador de ADP/ATP mitocondrial, también llamado translocasa de nucleótido de adenina, lleva a cabo uno de los pasos de transporte más prolíficos del cuerpo humano. El portador importa ADP citosólico a la matriz mitocondrial para la conversión en ATP por la ATP sintasa y exporta ATP al espacio intermembrana, que confluye con el citoplasma, para impulsar los procesos que requieren energía de la célula, como parte integral de fosforilación oxidativa 4. El portador cicla entre dos estados, que se denominan convencionalmente estado de matriz abierta y estado de citoplasma abierto, debido a la orientación del sitio de unión al sustrato hacia estos compartimentos5,6. Los estudios funcionales y estructurales se han visto favorecidos por la disponibilidad de inhibidores específicos de estado. El transportador está bloqueado en un estado abierto del citoplasma por atractilósido (ATR)7 y carboxyatractilósido (CATR)8,9, mientras que está bloqueado en un estado abierto de matriz por el ácido bongkrekic (BKA)10,11,12. Ambos estados unidos al inhibidor son abortivos porque la inhibición se logra evitando la unión del sustrato y atrapando al portador en una conformación estructural que no forma parte del ciclo de transporte5,6.

Como la mayoría de los miembros de SLC25, el transportador ADP/ATP consta de tres repeticiones de secuencias homólogas de ~100 aminoácidos cada una13, que se pliegan en una estructura pseudosimétrica triple con una vía de translocación central para los sustratos14. La estructura atómica del transportador de ADP/ATP bovino en el estado abierto citoplásmico unido a CATR mostró que cada repetición de secuencia codifica un dominio que consiste en una hélice α transmembrana de número impar (H1, H3, H5), un bucle que contiene un hélice (h12, h34, h56) que corre paralela a la membrana en el lado de la matriz y una hélice α transmembrana de número par (H2, H4, H6) 15 (Fig. 1 complementaria). Esta topología básica fue confirmada por las estructuras atómicas de los portadores de ADP/ATP fúngicos bloqueados en el estado abierto citoplásmico unido a CATR16 y en el estado abierto de matriz unido a BKA17.

En cada uno de los tres dominios, la hélice impar, la hélice matriz y la parte N-terminal de la hélice par hasta el 'punto de contacto'17,18,19 constituyen el elemento central, mientras que la parte C-terminal parte de la hélice con números pares forma el elemento de puerta 17 (Fig. 1 complementaria). La interconversión entre los dos estados se produce de forma alterna20 e implica amplios movimientos de los seis elementos estructurales, lo que convierte al transportador ADP/ATP en el transportador de solutos más dinámico identificado hasta la fecha5,17. Los tres elementos de puerta abren y cierran el lado citoplásmico del transportador, mientras que los tres elementos centrales cierran y abren el lado de la matriz, alternativamente. La apertura y el cierre están regulados por la interrupción y formación de dos redes de puentes salinos y llaves: la red de puentes salinos de la matriz del motivo [PS]x[DE]xx[KR]15,16 y la abrazadera de glutamina16 en los elementos centrales y el citoplasma. red de puentes de sal del motivo [FY][DE]xx[RK]17,20,21 y tirantes de tirosina17 en los elementos de la puerta (Fig. 1 complementaria). El movimiento coordinado de estos seis elementos estructurales está impulsado por la unión y liberación del sustrato como la única fuente directa de entrada de energía22,23.

En el ciclo de transporte, la unión del sustrato y los cambios conformacionales son procesos interdependientes, lo que significa que debe haber una serie continua de estados unidos al sustrato altamente dinámicos: desde el estado abierto del citoplasma, pasando por un estado ocluido, hasta el estado abierto de la matriz y atrás. Durante este proceso, las moléculas de ADP y ATP pueden adoptar muchos conformadores diferentes, ya que el portador cambia entre diferentes conformaciones. Por lo tanto, es necesario desenredar este complejo proceso antes de que podamos abordarlo mediante análisis estructurales directos.

Los estudios bioquímicos que utilizaron análogos de nucleótidos no transportables, realizados antes de la disponibilidad de estructuras, propusieron sitios de unión al sustrato en los bucles de la matriz24,25,26,27 y la región C-terminal27. Más tarde, los análisis de secuencia, que utilizaron restricciones químicas y de distancia18,19 o desviación de pseudosimetría20 como conceptos, apuntaron hacia una ubicación en la parte central de la cavidad, que incluía tres "puntos de contacto"18,19 (Fig. 1 complementaria) . Por el contrario, las simulaciones de dinámica molecular destacaron las interacciones de sustrato a lo largo de la vía de translocación28,29,30,31. Evidentemente, los diferentes estudios no han apuntado a una ubicación de consenso para el sitio de unión al sustrato y, por lo tanto, su determinación experimental será un primer paso esencial para abordar los problemas clave de la unión al sustrato y el acoplamiento conformacional del transportador ADP/ATP mitocondrial.

Aquí, proporcionamos la identificación experimental directa de los residuos involucrados en la unión del sustrato mediante la combinación de ensayos funcionales con estudios de unión, utilizando mutantes de reemplazo de alanina de la vía de translocación del sustrato (Fig. 1). Nuestro enfoque identifica todos los residuos que interactúan con los sustratos, independientemente del estado conformacional. La identificación de los residuos del sitio de unión proporciona el marco para resolver detalles moleculares importantes del mecanismo de unión y transporte. Es importante destacar que los residuos involucrados en la unión de ADP y ATP son los mismos, lo que explica la naturaleza electrogénica completamente reversible del transporte.

una vista de membrana del modelo de homología de TtAac en el estado abierto citoplásmico (izquierda) y la estructura determinada experimentalmente de TtAac en el estado abierto de matriz (derecha) (código PDB: 6gci cadena A). Los residuos analizados en este estudio se indican como barras amarillas, mientras que los residuos de la matriz y las redes citoplásmicas como barras negras, con interacciones iónicas mostradas como guiones magenta. Las superficies accesibles al agua, determinadas por HOLE59, se muestran en azul transparente. b Los residuos de las hélices transmembrana que recubren la vía de translocación, analizados en este estudio, están marcados en azul y los residuos de las redes de puentes salinos en negro.

Con el fin de identificar los residuos que podrían estar involucrados en la unión del sustrato, analizamos los residuos accesibles al agua en el transportador ADP/ATP mitocondrial del hongo Thermothelomyces thermophila (TtAac), que es más estable en detergentes que los ortólogos de levadura32. Para identificar todos los residuos candidatos, utilizamos la estructura abierta de matriz determinada experimentalmente de TtAac17 y un modelo de homología comparativa del estado abierto citoplasmático, basado en las estructuras resueltas del estado abierto citoplasmático (entradas PDB 1okc, 4c9h, 4c9q y 4c9j ). En total, se identificaron 36 residuos en la ruta de translocación, que abarcan todos los residuos accesibles por solvente con la excepción de las dos redes de puentes salinos, que se conservan universalmente, independientemente de la especificidad del sustrato, y tienen un papel definido en el mecanismo15,16, 17,20,21 (Fig. 1). Cada uno de los residuos seleccionados fue reemplazado por alanina, generando un conjunto de 36 variantes.

En primer lugar, realizamos estudios de complementación funcional utilizando la cepa WB-12 de transporte deficiente de Saccharomyces cerevisiae33. La expresión de TtAac de tipo salvaje restauró por completo el crecimiento de WB-12 (100% de complementación), mientras que el control, que contenía un vector vacío, no mostró crecimiento (Fig. 2 complementaria). De las 36 variantes de alanina, solo cinco complementaron el crecimiento en un grado similar al del tipo salvaje, mientras que 19 no mostraron ningún crecimiento (<3 %) y otras 12 mostraron un crecimiento significativamente reducido (entre 18 y 76 %) (Fig. 2a). , Figura complementaria 2). Los 19 residuos esenciales para la función están dispersos por toda la cavidad central (Fig. 2b) y están muy conservados entre los ortólogos portadores de ADP/ATP (Fig. 3 complementaria). Se ha demostrado previamente que los residuos cargados K30, R88, R197, R246 y R287 son importantes para el crecimiento y la actividad de transporte en otros ortólogos34,35,36,37,38,39. Estos datos mostraron que la mayoría de los residuos en la ruta de translocación son importantes para un intercambio eficiente de ADP/ATP.

a Porcentaje de complementación funcional de la cepa WB-12 que expresa variantes de TtAac en comparación con la expresión del portador de tipo salvaje (100% de complementación), según lo determinado por densitometría de pruebas puntuales de dilución en serie en medio YPG (Fig. 2 complementaria). Las barras y las barras de error representan la media y la desviación estándar de cuatro experimentos independientes. El análisis de significación se realizó con pruebas t de dos colas para una muestra, como se describe en "Métodos" (p > 0,05, ns; p ≤ 0,05, *; p ≤ 0,01, **; p ≤ 0,001, ***; p ≤ 0,0001, ****). Los colores representan las tres propiedades de crecimiento observadas: crecimiento no afectado significativamente (ns), azul claro; crecimiento significativamente afectado (0.5 ≥ p > 0.0001), marino; sin crecimiento (p ≤ 0.0001), azul oscuro. b Posición de los residuos analizados en la estructura TtAac unida a BKA abierta en matriz (código PDB: 6gci cadena A), que se muestra como una representación de dibujos animados. Las esferas representan los átomos de carbono CA y están codificadas por colores como se describe en a. Los datos de origen para esta cifra se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los ensayos de complementación no pueden determinar qué aspecto de la estructura o función se ve afectado por la mutación. La baja afinidad de unión de los sustratos (rango μM23), un aspecto crucial del mecanismo de transporte, impide el uso de ensayos de unión. Como los ensayos de complementación no pueden identificar los residuos involucrados específicamente en la unión del sustrato, utilizamos un ensayo de cambio de termoestabilidad, que monitorea el desarrollo de una población de proteínas con la sonda reactiva con tiol 7-dietilamino-3-(4-maleimidofenil)-4-metilcumarina ( CPM) en una rampa de temperatura40. Se puede obtener una temperatura aparente de fusión (Tm) como parámetro de termoestabilidad32 en el punto en el que la velocidad de despliegue es máxima. El ensayo CPM se puede utilizar para evaluar el estado de plegamiento y la estabilidad de las proteínas de membrana en diferentes condiciones32,41,42. Además, los cambios en los perfiles de termoestabilidad brindan información sobre la unión de inhibidores17,21,32,43 y otros efectores44. Recientemente, se demostró que también pueden ocurrir cambios en la unión de sustratos a proteínas de transporte32,45, porque se forman interacciones específicas entre la proteína y las moléculas de sustrato45. En principio, la interrupción de estas interacciones a través de mutaciones conduciría a una disminución en el cambio de termoestabilidad inducido por el sustrato, proporcionando una forma de identificar los residuos directamente involucrados en la unión del sustrato.

Para realizar los experimentos de cambio de termoestabilidad, utilizamos proteínas purificadas, expresadas en la cepa de levadura W303-1B, que permitió la sobreexpresión de las 36 variantes, independientemente de su actividad funcional. Todas las variantes se expresaron a niveles similares y se dirigieron correctamente a las mitocondrias. Se purificaron con éxito mediante la unión por afinidad de níquel y la escisión de etiquetas de afinidad en la columna (Fig. 4 complementaria). Su estado de plegamiento e integridad estructural se evaluaron con ensayos CPM en presencia y ausencia de los inhibidores específicos CATR y BKA17,21,32 (Fig. 3). La estabilidad de la mayoría de los mutantes no se vio afectada por las mutaciones individuales, ya que su Tm aparente no fue significativamente diferente (48,2–52,8 °C) del tipo salvaje (50,2 ± 0,6 °C) (Fig. 3a). Las excepciones fueron las variantes L41A, Q44A, T146A, Y239A y N284A, que estaban en un estado desplegado, a juzgar por la alta fluorescencia inicial y la ausencia de una curva de despliegue sigmoidal (Fig. 5a complementaria). En particular, todos estos residuos están ubicados en la puerta de la matriz (Figura complementaria 5b, c). La puerta de matriz proporciona una capa de aislamiento, evitando la disipación de la fuerza motriz del protón a través de la fuga de protones, cuando el portador está en el estado citoplásmico abierto17. Además, el residuo Q44 es la abrazadera de glutamina entre H1 y H516.

a Datos de termoestabilidad CPM de cada proteína en ausencia de efectores (arriba), o en presencia de CATR (centro) o BKA (abajo). Las barras y las barras de error representan la media y la desviación estándar de la muestra de ocho experimentos independientes para el tipo salvaje y 2–7 para las variantes. El análisis de significancia para cada condición se realizó con ANOVA unidireccional, como se describe en "Métodos". Solo se indican los significativos (p > 0,01, ns; p ≤ 0,01, *; p ≤ 0,001, **; p ≤ 0,0001, ***; p ≤ 0,00001, ****). b Vista lateral de la estructura de estado abierto citoplásmico de ScAac2 en complejo con CATR (código PDB: 4c9h cadena A). Los residuos que interactúan de ScAac2 se conservan en TtAac, con la excepción de K104 que es R100 en TtAac y las dos proteínas comparten una identidad de secuencia del 74 %. Para facilitar la comparación, utilizamos el etiquetado TtAac (Fig. 3 complementaria). Los residuos que forman interacciones iónicas (guiones amarillos) y contactos hidrofóbicos con CATR (marinos) se muestran en azul oscuro y marrón, respectivamente. El residuo K104 de ScAac2 se ha modelado a Arg (R100) para TtAac. c Vista de matriz de la estructura de matriz abierta de TtAac con BKA unido (código PDB: 6gci cadena A). Los residuos que forman interacciones iónicas (guiones amarillos) o enlaces de hidrógeno (guiones negros) con BKA (naranja) se muestran en violeta, mientras que los residuos que forman contactos hidrófobos se muestran en cian. Los datos de origen para esta cifra se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Es importante destacar que las 31 variantes plegadas, comenzando desde el estado sin ligando, podrían unirse a ambos inhibidores, como es evidente por los cambios a valores de Tm aparentes más altos, lo que confirma que los transportadores sin ligando estaban plegados. Sólo cuando el residuo mutado participa en interacciones específicas con el inhibidor se observa una reducción o supresión del cambio térmico. De esta manera, fue posible mapear los sitios de unión de los inhibidores (Fig. 3b, c), que coincidieron bien con la mayoría de las interacciones observadas en las estructuras de los estados unidos a CATR y BKA15,16,17. El acuerdo es notable, dado que los datos de termoestabilidad se miden con portadores en solución a temperaturas en el rango de 25 a 90 °C, mientras que las estructuras cristalinas se determinan en nitrógeno líquido a -196 °C. Algunas discrepancias aparentes requieren más comentarios. La estructura bovina15 muestra que los residuos equivalentes de K30 y R246 interactúan con CATR a través de aguas ordenadas, de acuerdo con los cambios reducidos observados para las variantes de alanina relevantes (Fig. 3b). Los residuos L135 y V138 podrían formar contactos de van der Waals con el grupo isovalérico de CATR. En el caso de BKA, los mutantes F97A, R100A, N123A, Y204A y L295A presentaron un desplazamiento significativamente reducido, aunque estos residuos no participan directamente en su unión. Forman parte de los frenos de tirosina y del tapón hidrofóbico del estado de matriz abierta17 y, por lo tanto, son fundamentales para su formación, un requisito para la unión de BKA. Se hizo una observación similar para los residuos que componen la red citoplasmática21. En general, el análisis de inhibidores proporcionó una prueba de principio de que este ensayo puede usarse para detectar residuos involucrados en interacciones proteína-ligando. Además, los datos de termoestabilidad demostraron colectivamente que, además de cinco variantes (Fig. 5 complementaria), todas las proteínas sin ligando estaban bien plegadas y eran adecuadas para los análisis de unión al sustrato.

Luego determinamos un rango de concentración apropiado para caracterizar los cambios de termoestabilidad inducidos por el sustrato utilizando los portadores sin ligando. Los cambios se expresaron como un valor de ΔTm, calculado restando la Tm específica de proteína aparente en ausencia de sustrato de la Tm aparente en cada concentración de sustrato. De acuerdo con trabajos previos45, los valores de ΔTm del tipo salvaje aumentaron de manera dependiente de la concentración, hasta la saturación a 12 mM (ΔTm = 8,9 ± 1,8 °C) (Fig. 6 complementaria). Sobre la base de este experimento de titulación, se seleccionaron cinco concentraciones representativas de ADP y ATP (0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM) para probar la respuesta de las variantes. Observamos que estas medidas no proporcionan una evaluación cinética, porque las tasas de activación y desactivación del sustrato aumentan con el aumento de la temperatura y porque el desdoblamiento y el etiquetado de la proteína son irreversibles. La meseta se produce porque la unión del sustrato no puede evitar el despliegue a estas temperaturas elevadas.

Posteriormente, medimos los cambios de termoestabilidad en presencia de ADP y ATP para las 31 variantes plegadas. Con respecto a su respuesta al sustrato, se clasificaron en tres clases (Figs. 4, 5). En la primera clase, las variantes K30A, R88A, R197A, R246A y R287A no mostraron cambios de termoestabilidad dependientes de la concentración en presencia de cualquiera de los sustratos (Fig. 4a), lo que indica que cada uno de estos residuos forma una interacción crítica con el sustrato. Las variantes consistentemente no mostraron crecimiento en los ensayos de complementación (Fig. 2a, Fig. 2 complementaria). Estos residuos cargados positivamente se encuentran en el medio de la cavidad llena de agua (Fig. 4c) y su reemplazo por alanina da como resultado la pérdida de una carga positiva.

a, b Valores de cambio de termoestabilidad (ΔTm) determinados a una concentración de sustrato de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM para las variantes de reemplazo de alanina única y de tipo salvaje. Los círculos y las barras de error representan la media y la desviación estándar de ocho experimentos independientes para el tipo salvaje y de 3 a 7 para las variantes. Los círculos vacíos y llenos representan ADP y ATP, respectivamente. Los datos de la proteína de tipo salvaje se muestran en negro, mientras que los de las variantes se muestran en rojo (a) o en naranja (b) para los residuos críticos e importantes, respectivamente. Tenga en cuenta que para varios puntos de datos, el valor medio y las barras de error de los grupos ADP frente a ATP son idénticos y, en consecuencia, su representación gráfica se superpone, con el marcador ADP en la parte superior. Las barras de error a veces están enmascaradas por el símbolo. Las diferencias significativas se evaluaron mediante ANOVA de dos vías con interacción, como se describe en "Métodos". Los valores significativos (p ≤ 0,01) se indican con * o # para ADP y ATP, respectivamente. c Estructura unida a BKA con matriz abierta de TtAac (código PDB: 6gci cadena A) (izquierda) y vista de primer plano (derecha) que muestra los residuos analizados en palitos y esferas rojos o naranjas para las representaciones de Gly. Las hélices se muestran en representación de dibujos animados de trigo y están etiquetadas. Los datos de origen para esta cifra se proporcionan como un archivo de datos de origen.

a, b Valores de cambio de termoestabilidad (ΔTm) determinados a una concentración de sustrato de 0,1, 0,5, 1, 5, 10 mM para las variantes de reemplazo de alanina única y de tipo salvaje. Los círculos y las barras de error representan la media y la desviación estándar de ocho experimentos independientes para el tipo salvaje y de 3 a 5 para las variantes. Los círculos vacíos y llenos representan ADP y ATP, respectivamente. Los datos de la proteína de tipo salvaje se muestran en negro, mientras que los datos variantes se muestran en verde. Tenga en cuenta que en varias ocasiones el valor medio y las barras de error de los grupos ADP vs ATP son idénticos y, en consecuencia, su representación gráfica se superpone, con el marcador ADP en la parte superior. Las barras de error son más pequeñas que el símbolo cuando no se muestran. La evaluación estadística se llevó a cabo como se describe en "Métodos". Los valores significativos (p ≤ 0,01) se indican con * o # para ADP y ATP, respectivamente. c Estructura abierta de matriz BKA unida a TtAac (código PDB: 6gci cadena A) (izquierda) y vista de primer plano (derecha) que muestra los residuos analizados en barra verde y esfera para representaciones de Gly. Las hélices se muestran en representación de dibujos animados de trigo y están etiquetadas. Los datos de origen para esta cifra se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La segunda clase de variantes de reemplazo de alanina involucraba seis residuos (N85, N96, L135, V138, G192 e Y196), que estaban cerca de los cinco residuos críticos y tenían perfiles de termoestabilidad significativamente alterados en comparación con el tipo salvaje (Fig. 4b ). Estas variantes mostraron cambios dependientes de la concentración en presencia de sustrato, pero fueron significativamente más pequeños que los de la proteína de tipo salvaje. En su mayoría, se obtuvieron diferencias significativas para las dos concentraciones más altas probadas, tanto para ADP como para ATP (Fig. 4b). Dado que los cambios inducidos por el sustrato no se eliminaron por completo, cada residuo contribuye a la unión del sustrato. En apoyo de su papel contribuyente, las variantes L135A, G192A y Y196A no crecieron en absoluto en el estudio de complementación (<3 %), mientras que N85A, N96A y V138A crecieron significativamente menos (42 ± 23 %, 18 ± 10 % y 53 ± 14% respectivamente) (Fig. 2a, Fig. 2 complementaria). En particular, el reemplazo de alanina no causó inestabilidad proteica o trastorno del bolsillo de unión (Fig. 3) para ninguna de las once variantes en estas dos clases, lo que enfatiza que los efectos observados son de hecho específicos para la unión al sustrato.

Es importante destacar que la tercera clase de variantes involucró a 20 de las 31 variantes, que presentaron cambios inducidos por el sustrato que no fueron significativamente diferentes de los de la proteína de tipo salvaje (Fig. 5). Los cambios de termoestabilidad de las proteínas mutantes S29A, V230A, G288A y G291A no fueron diferentes del tipo salvaje en cualquier concentración de ADP y ATP (Fig. 5a), y estas variantes fueron completamente funcionales (Fig. 2a, Fig. 2 complementaria). Aunque las variantes F97A, S189A, Y204, G235A y L295A no complementaron el crecimiento y T92A, Q93A, R100A, S134, Y200A, T231A y S238A se complementaron solo parcialmente (Fig. 2a, Fig. 2 complementaria), todas tenían cambios de termoestabilidad similares a la proteína de tipo salvaje en presencia de sustratos (Fig. 5a). Estos resultados demuestran que estas mutaciones afectaron pasos importantes del mecanismo de transporte, pero no la unión al sustrato.

Cuatro variantes presentaron algunas diferencias con el tipo salvaje, pero no consistentemente. La variante Y89A podría complementar el crecimiento parcialmente (36 ± 19 %) (Fig. 2a), pero exhibió mayores cambios que el tipo salvaje para ambos nucleótidos (significativo solo para ADP) (Fig. 5b), lo que indica que este residuo no está directamente involucrado en unión al sustrato. La variante N123A fue parcialmente activa (50 ± 9%) (Fig. 2a) y los cambios inducidos por el sustrato fueron significativamente diferentes del tipo salvaje solo a 5 mM (Fig. 5b). La cepa que expresa la variante V294 creció en glicerol a niveles de tipo salvaje (84 ± 14 %) (Fig. 2a) y la proteína purificada fue más estable (53,7 ± 0,5 °C) que la de tipo salvaje (50,2 ± 0,6 °C) ( Figura 3a). Esto dio como resultado una significación espuria a bajas concentraciones de sustrato, pero alcanzó niveles de tipo salvaje a la concentración más alta de ATP (Fig. 5b). Finalmente, la estabilidad de la proteína mutante I193A fue muy variable (Figs. 5b, 3a), lo que impidió una evaluación de la importancia de los cambios inducidos por el sustrato.

Los residuos que no están involucrados en la unión del sustrato se ubicaron a lo largo de la vía de translocación, pero también muy cerca de los que se demostró que participaban en la unión del sustrato (Fig. 5c). Estos resultados muestran que los ensayos de cambio de termoestabilidad pueden identificar con precisión los residuos individuales que participan en las interacciones proteína-sustrato y que la unión del sustrato se limita a un grupo de residuos en la ruta de translocación. Sorprendentemente, para todas las proteínas probadas, no hubo diferencias significativas entre los cambios térmicos inducidos por ADP o ATP en cualquier concentración de sustrato (Fig. 7 complementaria).

Los transportadores mitocondriales de ADP/ATP tienen características únicas que les permiten lograr un alto flujo de ADP y ATP a través de la membrana interna mitocondrial para sustentar nuestras actividades diarias. Además, han evolucionado para enfrentar el desafío de importar ADP cargado negativamente contra el gran potencial electroquímico generado a través de la membrana interna mitocondrial por la cadena respiratoria. A pesar de haber sido estudiado durante más de 55 años, todavía hay muchas preguntas abiertas sobre el mecanismo de transporte, en particular sobre la unión del sustrato y su efecto en la interconversión entre los estados abiertos de matriz y citoplasmático.

Se han realizado muchas propuestas para la ubicación del sitio de unión al sustrato19,20,24,25,26,27,28,29,30,31, pero aquí abordamos esta cuestión de manera experimental con los sustratos relevantes. Nuestro enfoque permite una evaluación completa del proceso de unión del sustrato, destacando solo las interacciones significativas. Habiendo investigado todos los residuos de la vía de translocación entre las dos redes de puentes salinos, hemos identificado aquellos con funciones críticas y contribuyentes en la unión del sustrato y hemos demostrado que se agrupan, aproximadamente a la mitad de la vía de translocación. La observación de que una sola mutación puede anular la unión por completo indica que no hay otros sitios de unión de sustrato significativos en otros lugares, como los bucles de matriz o la región C-terminal, como se afirmó anteriormente24,25,26,27. Es posible que otras interacciones observadas28,29,30,31 sean transitorias, incluidas las de la "escalera de tirosina"15,28, para las que no encontramos soporte experimental. Además, dado que los cambios de termoestabilidad inducidos por ADP y ATP no fueron estadísticamente diferentes entre sí en ninguna concentración para ninguna de las proteínas probadas (Fig. 7 complementaria), ambos sustratos deben unirse al mismo conjunto de residuos de manera similar (Fig. 6). Dado que los portadores de ADP/ATP funcionan como monómeros14,17,46,47,48,49,50, los pasos de importación y exportación deben ser consecutivos, lo que implica un mecanismo cinético de ping-pong.

Vistas laterales desde la membrana del estado abierto citoplásmico (izquierda) (ScAac2, código PDB 4c9h cadena A) y estado abierto de matriz (código PDB 6gci cadena A) (derecha) del transportador ADP/ATP mitocondrial. Los residuos que interactúan de ScAac2 se conservan en TtAac y, para facilitar la comparación, utilizamos el etiquetado de TtAac (Fig. 3 complementaria). Las superficies accesibles al agua, determinadas por HOLE59, se muestran en azul transparente. Los residuos de la cavidad llena de agua que tienen funciones críticas e importantes en la unión del sustrato se representan en rojo y naranja, respectivamente, mientras que los sustratos ADP y ATP se muestran en verde y cian, respectivamente. Las superficies accesibles al agua se muestran en azul.

En el caso de los residuos cargados positivamente K30, R88, R197, R246 y R287, los reemplazos individuales de alanina condujeron a la pérdida de función (Fig. 2a) y a la abolición completa de los cambios de termoestabilidad inducidos por el sustrato (Fig. 4a). Dadas sus propiedades químicas, estos residuos pueden participar en interacciones iónicas con los grupos fosfato de carga negativa de los nucleótidos. De esta manera, hacen contribuciones relativamente grandes a la energía de interacción general de la unión del sustrato, lo que facilita los cambios conformacionales necesarios para el transporte22,23. Por otro lado, el reemplazo de alanina de los residuos N85, N96, L135, V138, G192 e Y196 resultó en una pérdida parcial o completa de la función (Fig. 2a) y en cambios de termoestabilidad significativamente reducidos en presencia de sustratos (Fig. 4b). Dadas las propiedades químicas y las posiciones relativas de estos residuos, es probable que participen conjuntamente en la unión del resto de adenosina relativamente hidrofóbico, formando interacciones más débiles que los residuos cargados antes mencionados, es decir, interacciones de apilamiento hidrofóbico y aromático. Por lo tanto, harán contribuciones individuales más pequeñas a la energía de interacción general de la unión del sustrato.

Los análisis de secuencia anteriores, que consideraron las propiedades químicas de los sustratos y las limitaciones de distancia, propusieron que hay tres "puntos de contacto" involucrados en la unión del sustrato, que son universales para todos los miembros de la familia SLC25 y se encuentran en las hélices transmembrana pares18, 19 Posteriormente, se descubrió que también forman puntos de bisagra entre el núcleo y los elementos de puerta de los dominios de la proteína, vinculando así la unión del sustrato a un mecanismo de transporte común4,5,17. Los residuos críticos identificados en este estudio, R88 y R287, en H2 y H6 respectivamente, corresponden a los puntos de contacto I y III. El residuo crítico K30 en H1 se encuentra entre ellos a la misma altura en la cavidad central. Los residuos que contribuyen de manera importante a la unión, G192 e Y196 en H4, están en el punto de contacto II, mientras que L135 y V138 están cerca. Todos estos siete residuos son accesibles en ambos estados conformacionales y tienen confórmeros similares (Fig. 6), lo que demuestra que participan conjuntamente en la unión del sustrato, formando el principal sitio de unión al sustrato a lo largo de los cambios conformacionales. La ubicación central de este sitio es consistente con la formación y ruptura de la matriz y las puertas citoplásmicas en ambos lados, a medida que el portador cambia entre estados4,5,17. Además, también se demostró que es el punto de apoyo de todos los cambios conformacionales que ocurren durante el ciclo de transporte17.

Los cuatro residuos restantes forman dos pares de asparagina/arginina, N85/R246 y N96/R197, que se encuentran en lados opuestos del sitio principal. Tienen las mismas propiedades químicas y, por lo tanto, podrían cumplir funciones similares. La comparación de las estructuras abiertas del citoplasma y de la matriz muestra claramente que estos pares Asn/Arg cambian de confórmeros de una manera dependiente del estado (Fig. 6). En el estado abierto del citoplasma, los residuos N96/R197 apuntan hacia la apertura de la cavidad, mientras que son parte del principal sitio de unión en el estado abierto de la matriz. Por el contrario, los residuos N85/R246 apuntan hacia la apertura de la cavidad en el estado de matriz abierta, mientras que son parte del sitio de unión principal en el estado de citoplasma abierto (Fig. 6). Dado que estos pares apuntan a la apertura de la cavidad, es probable que sean responsables de la unión inicial y la liberación final de los nucleótidos.

En resumen, hay un solo sitio de unión para el resto de adenosina y varios residuos polares cargados positivamente para la unión de los restos de fosfato, que se involucran de manera dependiente o independiente del estado, lo que indica un proceso gradual. Su papel en el ciclo de transporte se puede explicar en un mecanismo por pasos, que es nuestro modelo actual de los eventos de unión al sustrato. Primero, el ADP ingresa a la cavidad del transportador en el estado citoplásmico por el movimiento browniano y la atracción electrostática28,29,30, y los restos de fosfato se acoplan con el par N96/R197 (Fig. 7a). Una vez unido, el resto de adenina hidrofóbico de ADP es libre de unirse al sitio de unión hidrofóbico/aromático (G192, Y196, L135 y V138) para el reconocimiento del sustrato, protegiéndolo de la fase acuosa (Fig. 7b)18,19,51. Este es un paso importante, ya que los transportadores mitocondriales de ADP/ATP tienen una especificidad estrecha, transportando solo ADP, ATP y sus desoxi-variantes30,51. A continuación, los restos de fosfato cargados negativamente se unen a los K30, R88 y R287 cargados positivamente del sitio de unión principal, posicionando la molécula de ADP en el área central y neutralizando su carga (Fig. 7c). Todos los puntos de contacto del sitio de unión ahora están activados, lo que permite avanzar a las siguientes etapas. El fosfato terminal de ADP comienza a acoplarse con el par N85/R246 (Fig. 7d), continuando los cambios conformacionales a los estados ocluido (Fig. 7e) y de matriz abierta (Fig. 7f). Se ha observado una pose similar, pero no idéntica, a la de la Fig. 7d en simulaciones MD28,30, pero los tiempos de simulación (<1 μs) fueron demasiado cortos para completar el medio ciclo (~0,5 ms). Finalmente, el par N85/R246 acerca el ADP a la boca de la cavidad y lo libera en la matriz mitocondrial para la síntesis de ATP (Fig. 7f). El ATP recién sintetizado es transportado fuera de la mitocondria por el transportador en una serie similar de interacciones y cambios conformacionales4,5,17, pero ocurriendo a la inversa (Fig. 7g-l).

Diferentes etapas del ciclo de transporte, a–d, l estado citoplasmático abierto, e, k estado ocluido y f–j estado abierto de matriz. Los sustratos ADP y ATP tienen un resto de adenina (verde y cian, respectivamente), un resto de ribosa (amarillo) y dos o tres restos de fosfato, respectivamente (naranja). El sitio de unión de adenosina está representado por una forma de herradura, mientras que los residuos polares y cargados positivamente del sitio de unión se muestran en azul y verde, respectivamente. Las puntas de flecha negras muestran los movimientos del sustrato que inducen la conversión entre estados, mientras que las rojas indican la entrada y salida de los sustratos.

De esta manera gradual, las moléculas grandes y conformacionalmente diversas de ADP y ATP se dirigen a través de una serie de confórmeros que acompañan los complejos cambios conformacionales necesarios para su translocación. Además, la posición del sitio central con los dos pares Asn/Arg a ambos lados indica que los sustratos pasan por un conjunto similar de interacciones independientemente de la dirección de la que provienen, lo que explica la naturaleza reversible observada del transporte. De acuerdo con observaciones anteriores, la dirección del transporte no está determinada por las propiedades de la proteína, sino por los gradientes químicos de los sustratos y el potencial de membrana.

Además, las propiedades electrostáticas de los residuos de unión identificados pueden explicar un aspecto importante de la bioenergética del transporte de nucleótidos de adenina en las mitocondrias. Durante la importación de ADP se mueven tres cargas negativas contra el potencial de membrana, mientras que durante la exportación de ATP se mueven cuatro cargas negativas con él. Los movimientos de carga se han medido directamente utilizando nucleótidos enjaulados, dando valores de +0,3 o +0,5 para el paso de importación de ADP y −0,7 o −0,5 para el paso de exportación de ATP52,53. Con base en estas observaciones, se propuso que el sitio de unión al sustrato debería contener 3,3 o 3,5 contracargas positivas52,53. Estas medidas concuerdan bien con las tres cargas positivas de K30, R88 y R287 en el sitio de unión principal, que se reorientan con el sustrato hacia el otro compartimento, a medida que el soporte cambia de conformación. Las cargas parciales podrían deberse a las interacciones dependientes del estado de R197 o R246, que son transitorias y de naturaleza más débil. Las cargas parciales estimulan tanto la importación de ADP como la exportación de ATP en presencia de un gran potencial de membrana y minimizan la fuerza electroforética sobre los sustratos unidos en el estado ocluido. El intercambio equimolar observado de ADP y ATP no está determinado por las propiedades del sitio de unión al sustrato, sino por las dos redes de puentes salinos, que evitan los cambios conformacionales en ausencia de sustrato. Solo la unión del sustrato conducirá a un cambio conformacional, ya que proporciona un aporte de energía para romper la red22,23 y, por lo tanto, habrá un intercambio uno por uno de los dos sustratos.

Curiosamente, las variantes K30A, R88A y R287A fueron más termoestables (57,3 ± 1,2, 53,1 ± 1, 64,4 ± 0,2 °C respectivamente) que el portador de tipo salvaje (50,2 ± 0,6 °C) (Fig. 3), debido a la eliminación de una de las cargas positivas que se encuentran muy juntas en la cavidad central. Por lo tanto, se puede evitar que el portador se interconvierta entre estados en ausencia de sustratos, debido a la barrera de alta energía impuesta por la repulsión de estas tres cargas positivas cuando el portador cambia de conformación. La unión del ADP y ATP con carga negativa a estos residuos reduciría la energía libre al neutralizarlos, lo que conduciría a la translocación del sustrato. Las mutaciones G291A y V294A, que afectan a los residuos interhelicoidales17, pueden impedir la dinámica, mientras que R100A, que es equivalente a un corsé de tirosina17, puede debilitar la red citoplasmática, lo que hace que el estado citoplasmático abierto sea estocásticamente más probable. Así, estas mutaciones también hacen que la interconversión de estados sea menos favorable, dando lugar a variantes más estables (fig. 3).

En conclusión, las propiedades del sitio de unión identificado explican muchas características del mecanismo que hasta ahora no tenían explicación molecular. Los mismos principios, como se descubrió aquí, podrían aplicarse a la unión y el transporte de sustratos para otros miembros de la familia de transportadores mitocondriales SLC25, que actualmente se encuentran bajo investigación.

El sujeto del estudio fue el transportador ADP/ATP mitocondrial de Thermothelomyces thermophila. Para la expresión del portador de ADP/ATP mitocondrial de tipo salvaje, el gen se optimizó por codones y se clonó en un vector derivado de pYES3/CT (Carlsbad, CA, Invitrogen, EE. UU.), que contiene el promotor pPIC2 constitutivamente activo del portador de fosfato pic2 de Saccharomyces cerevisiae21,46. Se introdujeron reemplazos de alanina individuales en las posiciones indicadas para cada variante reemplazando el codón relevante con GCT (el codón más frecuente para la alanina en el genoma de la levadura), usando PCR54 de extensión superpuesta con polimerasa KOD HotStart (Novagen). Los cebadores para introducir las mutaciones se muestran en la Tabla complementaria 1. Los plásmidos de expresión se transformaron en las cepas de S. cerevisiae WB-12 (MATα ade2-1 trp1-1 ura3-1 can1-100 aac1 :: LEU2 aac2 :: HIS3) 33, en el que los genes aac1 y aac2 están interrumpidos y en la cepa W303-1B (MATα leu2-3, 112 trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15), usando el ADN portador LiAc/SS/ Método PEG55. Los transformantes exitosos se seleccionaron en placas de medio de abandono de triptófano completo sintético (Formedium), suplementadas con glucosa al 2% (p/v). Se usó como control un vector vacío, generado restaurando el sitio de clonación múltiple del vector.

La cepa WB-12 que expresa las proteínas de tipo salvaje o mutantes o el vector vacío se cultivó durante la noche en un medio sin triptófano completo sintético suplementado con glucosa al 2 % (p/v). Las células se lavaron tres veces con agua estéril ultrapura, de modo que la glucosa se eliminó por completo y se diluyó a una DO600 de 1. Se realizaron cuatro diluciones en serie (1:10) y se dispensaron 3,5 μL del cultivo inicial y cada dilución en un placa YPG y se incubó a 30 °C durante 72 h. Solo la segunda y la tercera dilución se usaron para el análisis. Cada placa contenía el tipo salvaje y el control de vector vacío. El crecimiento de los mutantes de sustitución de alanina y de tipo salvaje se cuantificó mediante densitometría. Las imágenes escaneadas o fotografías de las placas se analizaron utilizando el software Fiji (versión 2.3.0/1.53q)56, específicamente la herramienta 'Gel analysis'. Se midió la densidad de las colonias (superficie total) y se expresó como porcentaje de la densidad del tipo salvaje de la misma placa y dilución, después de restar a ambas la densidad del vector vacío. Se promediaron los porcentajes de crecimiento calculados a partir de la segunda y tercera diluciones (10-2, 10-3) y este valor constituyó una repetición biológica. Los experimentos se repitieron de forma independiente cuatro veces.

Para cada proteína de tipo salvaje y variante, se utilizó un precultivo de 1 L de la cepa de expresión para inocular 10 L de medio YPG más glucosa al 0,1 % (p/v) en un biopaquete de 15 L esterilizable en autoclave Applikon con eZ control. Se utilizó la cepa WB-12 o W303-1B como base genética para el tipo salvaje, ya que no se observaron diferencias en el rendimiento, la estabilidad o la actividad del portador purificado de ninguna de las cepas. Para las variantes, se seleccionó la cepa W303-1B, ya que esta cepa permitía una expresión suficiente, independientemente del estado funcional de la proteína mutante. Las células se lisaron utilizando un DYNO-MILL (Willy A. Bachofen) y las mitocondrias se aislaron57, se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70 °C hasta su uso.

Las mitocondrias de levadura aisladas (~350 mg de proteína total) se solubilizaron mediante resuspensión en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, glicerol al 10 % (v/v), NaCl 150 mM, imidazol 20 mM, pH 7,5, uno completo sin EDTA. tableta de cóctel de inhibidor de proteasa (Roche) y dodecil-β-maltósido al 1% (p/v) (Glycon Biochemicals GmbH) seguido de agitación suave a 4 °C durante 1 h. El material particulado se eliminó mediante ultracentrifugación (235 000 × g, 45 min, 4 °C) y la fracción soluble se incubó con perlas de níquel Sepharose (GE Healthcare) previamente lavadas y equilibradas (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) para 2 h, a 4 °C, con agitación suave. Las proteínas no unidas se eliminaron por centrifugación (200 × g, 5 min, 4 °C) y la fracción unida se colocó en una columna vacía (BioRad), donde se lavó con 40 volúmenes de columna de tampón A (20 mM HEPES-NaOH pH 7,5, NaCl 150 mM, imidazol 20 mM pH 7,5, dodecil-β-maltósido al 0,1 % (p/v), tetraoleoil cardiolipina 0,1 mg/ml), seguido de 25 volúmenes de columna de tampón B (HEPES-NaOH 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, dodecil-β-maltósido al 0,1 % (p/v), tetraoleoil cardiolipina 0,1 mg/ml). Luego, el material de la columna se resuspendió con 500 μL de tampón B y se complementó con CaCl2 5 mM y 10 μg de factor Xa proteasa (New England Biolabs) para la digestión en la columna, durante la noche a 10 °C, con agitación suave. Para las variantes N123A, G192A, I193A, R197A y R246A, el paso de digestión en columna se redujo a 2 h, utilizando 30 μg de factor Xa proteasa, debido a la inestabilidad de la proteína con el tiempo. Después del tratamiento con Factor Xa, la proteína escindida se separó de la resina de níquel Sepharose con una columna de centrifugado Proteus Midi vacía (Generon) (200 × g, 5 min, 4 °C). Las concentraciones de proteínas se midieron con un espectrofotómetro (NanoDrop Technologies) a 280 nm o el kit de ensayo de proteínas con ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific). Se usó proteína recién purificada para los ensayos de cambio de termoestabilidad CPM.

La evaluación de la estabilidad de la población de proteínas para el tipo salvaje y variantes en presencia y ausencia de efectores (sustratos o inhibidores) se realizó mediante desdoblamiento térmico, inducido por una rampa de temperatura32. En este ensayo, los residuos de cisteína inicialmente inaccesibles quedan expuestos al solvente a través de la desnaturalización térmica y reaccionan con el fluoróforo N-[4-(7-dietilamino-4-metil-3-coumarinil)fenil]-maleimida (CPM)40. La reacción da lugar a la formación de aductos fluorescentes, que se controla mediante un instrumento rotatorio de PCR cuantitativa (qPCR) (Rotor gene Q, Qiagen). Para cada experimento, se diluyeron 5 mg/ml de solución madre de CPM en sulfóxido de dimetilo a 0,1 mg/ml en tampón B de purificación (HEPES-NaOH 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, dodecil-β-maltósido al 0,1 % (p/v) , 0,1 mg/ml de tetraoleoil cardiolipina) y se equilibró en la oscuridad, durante 10 min, a temperatura ambiente. Se mezclaron tres microgramos de proteína purificada con el efector correspondiente (donde se indique) y se diluyeron en el Tampón B hasta un volumen final de 45 μL, al que se añadieron 5 μL de solución de CPM de 0,1 mg/mL. Los efectores ADP y ATP se agregaron a concentraciones finales de 0.1, 0.5, 1, 5 y 10 mM, CATR a 20 μM y BKA a 20 μM más 5 μΜ ADP, que se agregó para permitir que los transportadores cambiaran de estado a fin de para unirse al inhibidor21. La mezcla se agitó muy brevemente y se incubó en la oscuridad, durante 10 min, a 4 °C, antes de colocarla en el instrumento de qPCR. Posteriormente, la población de proteínas se ensayó en un gradiente de temperatura de 25 a 90 °C, correspondiente a una tasa de ~4 °C por min. La fluorescencia creciente emitida por el aducto proteína-fluoróforo se midió en el canal HRM de la máquina (excitación a 440-480 nm y emisión a 505-515 nm). Los perfiles de despliegue se analizaron con el software Rotor-Gene Q 2.3, donde se utilizó el punto de inflexión de las curvas de despliegue para determinar la temperatura aparente de fusión (Tm) de las proteínas en las diferentes condiciones probadas. Se obtuvo un valor de ΔTm restando la Tm de la proteína en ausencia de efectores de la Tm en cada concentración de los efectores.

El modelo de TtAac en el estado citoplásmico abierto se generó con Modeller versión 9.2258, utilizando las alineaciones basadas en la estructura de las cadenas A de los códigos PDB 1okc, 4c9h, 4c9q y 4c9j y las restricciones de que los residuos 140 a 156 deben ser helicoidales como en la estructura de estado abierto de matriz de TtAac, código PDB: 6gci. La puntuación DOPE se utilizó para verificar los modelos. La puntuación de choque se mejoró al minimizar la energía de la estructura en Chimera. Después de la inspección de los residuos del sitio de unión, K30 había cambiado de posición en comparación con el residuo equivalente en 4c9h y se devolvió al confórmero original. Finalmente, los extremos N y C se truncaron para reflejar la estructura en 4c9h. Las superficies accesibles al agua fueron determinadas por HOLE59.

Los resultados en todas las figuras se muestran como la media ± DE del número indicado de experimentos. El análisis estadístico de los datos se realizó con GraphPad Prism versión 9.2.0 (GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU.) como se describe a continuación. En los experimentos de complementación, las diferencias de crecimiento se analizaron mediante una prueba t de una muestra de dos colas, comparando el porcentaje de crecimiento de las variantes con el porcentaje medio de crecimiento del tipo salvaje. Las diferencias entre los valores de Tm específicos de la variante frente al valor de Tm de tipo salvaje se evaluaron con ANOVA unidireccional, seguido de una prueba post hoc de Dunnett para corregir las comparaciones múltiples. Las diferencias entre los valores de Tm específicos de variante frente a la Tm de tipo salvaje en presencia de inhibidores (CATR y BKA) se evaluaron de la misma manera (ANOVA unidireccional, seguido de la prueba post hoc de Dunnett). Con respecto a los cambios térmicos inducidos por el sustrato (ADP o ATP) en las variantes de proteínas, las diferencias entre los grupos se evaluaron mediante un ANOVA de dos vías con interacción para cada concentración de nucleótidos probada. Los efectos simples entre las variantes de proteína dentro del nivel de sustrato se analizaron y corrigieron usando la prueba post hoc de Dunnet contra la proteína de tipo salvaje (visualizada en las Figs. 4, 5). Los efectos simples entre sustratos para cada nivel de proteína se analizaron y corrigieron mediante la prueba post hoc de Sidak (visualizados para 10 mM en la Fig. 7 complementaria). Las diferencias se consideraron significativas al nivel del 1%.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento. Todos los datos de cambio de termoestabilidad y complementación generados en este estudio se han depositado en la base de datos de Mendeley con el código de acceso https://doi.org/10.17632/mrhnw45w5y.1 (https://data.mendeley.com/datasets/mrhnw45w5y/1) Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Nos gustaría agradecer al Dr. Gonçalo C. Pereira por su asesoramiento sobre los análisis estadísticos y al Dr. Chancievan Thangaratnarajah por generar el vector derivado pYES3/CT vacío utilizado en los estudios de complementación. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Médica Grant MC_UU_00028/2 a ERSK.

Unidad de Biología Mitocondrial del Consejo de Investigación Médica, Universidad de Cambridge, Campus Biomédico de Cambridge, Edificio Keith Peters, Hills Road, Cambridge, CB2 0XY, Reino Unido

Vasiliki Mavridou, Martin S. King, Sotiria Tavoulari, Jonathan J. Ruprecht, Shane M. Palmer y Edmund RS Kunji

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VM, MSK, ST y ERSK diseñaron la investigación, SMP llevó a cabo las fermentaciones a gran escala, VM y MSK realizaron la biología molecular y las preparaciones mitocondriales, VM purificó las proteínas y realizó el análisis biofísico, VM y ERSK analizaron los datos, VM, JJR y ERSK prepararon las cifras, VM, MSK, ST, JJR y ERSK escribieron el artículo

Correspondencia a Edmund RS Kunji.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Mavridou, V., King, MS, Tavoulari, S. et al. La unión del sustrato en el transportador ADP/ATP mitocondrial es un proceso gradual que guía los cambios estructurales en el ciclo de transporte. Nat Comun 13, 3585 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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Recibido: 20 de diciembre de 2021

Aceptado: 14 junio 2022

Publicado: 23 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31366-5

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