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Jan 03, 2024

Diseño de agonistas de receptores con farmacocinética mejorada mediante el injerto de péptidos macrocíclicos en regiones cristalizables de fragmentos

Naturaleza Ingeniería Biomédica

Nature Biomedical Engineering volumen 7, páginas 164–176 (2023)Citar este artículo

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Las vidas medias cortas en la circulación y el transporte deficiente a través de la barrera hematoencefálica limitan la utilidad de las citocinas y los factores de crecimiento que actúan como agonistas de los receptores. Aquí mostramos que se pueden generar agonistas de receptores sustitutos con vidas medias más largas en circulación y tasas de transporte mejoradas a través de la barrera hematoencefálica mediante la inserción genética de farmacóforos de péptidos macrocíclicos en los bucles estructurales de la región cristalizable (Fc) de fragmentos de una inmunoglobulina humana. Utilizamos dicho enfoque de 'injerto de lazo', que conserva los niveles de expresión de la región Fc y su afinidad por el receptor Fc neonatal, para generar andamios de proteínas basados ​​en Fc con péptidos macrocíclicos que se unen al receptor tirosina proteína quinasa Met. Los agonistas de Met dimerizaron a Met, induciendo respuestas biológicas similares a las inducidas por su ligando natural. Además, el injerto de lazo de la región Fc del anticuerpo anti-transferrina-receptor de ratón con péptidos macrocíclicos de unión a Met mejoró la acumulación de los agonistas de Met resultantes en el parénquima cerebral en ratones. El injerto de lazo puede permitir terapias de proteínas de diseño con mayor estabilidad y farmacocinética.

El uso clínico de citoquinas y factores de crecimiento como terapias ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU.1,2, y su aplicación potencial en áreas emergentes, como la neurogénesis y la reparación cerebral3,4, es un tema de intensa investigación. Sin embargo, sus propiedades estructurales inherentes dificultan su ingeniería para mejorar la estabilidad fisicoquímica y la farmacocinética, en particular, para mejorar la vida media o la penetración de la barrera hematoencefálica (BBB). Los métodos existentes que controlan la farmacocinética de las proteínas terapéuticas incluyen la conjugación y fusión de poli(etilenglicol) con el fragmento de la región cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina5,6,7 para prolongar sus vidas medias; y fusión con Fab del anticuerpo anti-receptor de transferrina (TfR) para mejorar su penetración a través de la BBB8,9,10. Sin embargo, la medida en que estos métodos pueden mejorar la farmacocinética de las proteínas sin afectar negativamente a sus bioactividades depende de las propiedades de cada proteína5,6,7,8. Para superar las limitaciones estructurales inherentes de las citocinas y los factores de crecimiento, ha habido avances en el desarrollo de agonistas sustitutos que no están relacionados estructuralmente con los ligandos nativos11,12. A pesar de estos avances recientes, sigue existiendo una gran necesidad insatisfecha de métodos más robustos y versátiles para diseñar tratamientos proteicos con la estabilidad fisicoquímica y la farmacocinética deseadas.

Los péptidos macrocíclicos han surgido como una nueva clase prometedora de candidatos a fármacos que cuentan con una serie de características deseables, como la afinidad y especificidad de unión similares a las de los anticuerpos13,14, la capacidad de dirigirse a espacios químicos únicos15,16,17,18 y el descubrimiento eficiente a través de /diseño computacional y exhibición in vitro18,19,20,21. En general, los péptidos macrocíclicos muestran una mayor afinidad por las dianas que los péptidos lineales debido a sus estructuras cíclicas restringidas. Una posibilidad intrigante para extender la aplicabilidad de estos péptidos macrocíclicos es 'injertarlos' en andamios de proteínas para permitir combinaciones funcionales de péptido y proteína18,22,23,24,25,26. Sin embargo, el injerto de péptidos identificados de novo en bucles de proteína ha sido un desafío debido al posible mal plegamiento tanto del péptido injertado como de la proteína huésped26.

El desarrollo del sistema RaPID (descubrimiento integrado de péptidos aleatorios no estándar), que integra la visualización de ARN mensajero y la reprogramación del código genético, ha permitido el descubrimiento de péptidos macrocíclicos ciclados basados ​​en tioéter con una especificidad de unión exquisita contra proteínas diana16,17,18. En estudios anteriores, hemos demostrado que las secuencias de farmacóforo derivadas de RaPID se pueden implantar fácilmente en bucles de proteínas expuestos en la superficie y mantener las funciones del péptido huésped y la proteína huésped, lo que denominamos "injerto de lazo"27,28,29 . La compatibilidad de injerto excepcional observada probablemente se deba a la propiedad intrínseca de los motivos farmacóforos de plegarse a sí mismos en una conformación de unión al objetivo similar al macrociclo parental, incluso en el contexto de la estructura de bucle no relacionada de las proteínas del andamio18,30.

En este estudio, aprovechamos las propiedades de andamiaje deseables del fragmento Fc, su larga vida media, la versatilidad en combinación con Fab5,6,31,32 y la facilidad de producción para mostrar la viabilidad y la aplicación del injerto de lazo. Utilizando la Fc como andamio, generamos agonistas del receptor de Met que se caracterizan por una vida media notablemente mejorada y una penetrancia de BBB.

Met es un receptor de tirosina quinasa que se activa tras la dimerización provocada por su ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF). Met-HGF tiene una participación central en la morfogénesis durante el desarrollo, la reparación de heridas y la homeostasis de los órganos al estimular el crecimiento, la supervivencia y la migración celular33,34. La proteína HGF recombinante muestra eficacia terapéutica en modelos preclínicos34,35 y en pacientes con enfermedades específicas36,37. Sin embargo, su vida media corta y la incapacidad de administrarse más allá de la BBB han limitado durante mucho tiempo su potencial en aplicaciones médicas38,39. Para abordar estas deficiencias, insertamos mediante injerto de lazo la secuencia de farmacóforo linealizada de aMD4 o aMD5, dos péptidos macrocíclicos que se unen al ectodominio de Met40 en cada uno de los ocho bucles de Fc (Fig. 1a). Estas dos series de fragmentos Fc injertados con aMD4 o aMD5 (en adelante, Fc(aMD4) y ​​Fc(aMD5), respectivamente), cada uno de los cuales muestra dos ligantes de Met dentro de 31–42 Å entre sí, tienen el potencial de acercar dos receptores de Met en la superficie celular. Los niveles de expresión de Fc(aMD4) y ​​Fc(aMD5) en las células Expi293F fueron similares a los del control Fc, con la excepción de Fc(aMD5)T3 (Datos extendidos Fig. 1), lo que sugiere que el injerto de lazo generalmente preservó la alta expresión de Fc.

a, Se insertaron secuencias farmacóforas de aglutinantes de Met (aMD4 o aMD5; mostrados en rojo) en los bucles (T1 a B3; coloreados) de la proteína IgG1 Fc humana (PDB ID: 1h3w). Las secuencias de aminoácidos de Fc, los péptidos injertados y los sitios de injerto se muestran a la derecha. b,c, Activación de Met celular por Fc injertado con aMD4 (Fc(aMD4)) (b) o Fc injertado con aMD5 (Fc(aMD5)) (c). Las células EHMES-1 se trataron con variantes de Fc (coloreadas) o péptidos dímeros (grises). La activación celular de Met se cuantificó in situ con anticuerpo anti-fosfo-Met (Tyr1234/1235). Los resultados se muestran como media ± sem (n = 6 experimentos independientes) en porcentaje de fosfo-Met con respecto a la fosforilación de Met máxima inducida por HGF 1,1 nM. Izquierda: T1, T2 y T3. Medio: M2 y M3. Derecha: B1, B2 y B3.

Datos fuente

La activación de Met celular por Fc (aMD4) o Fc (aMD5) purificados dependía en gran medida del sitio de injerto (Fig. 1b, c), donde B3 era el sitio óptimo para aMD4 (Fig. 1b). Nuestros análisis muestran que Fc(aMD4)B3 activó Met con una concentración efectiva máxima media (CE50) comparable a la del péptido dímero aMD4 no injertado (CE50: 4,5 ± 0,2 nM frente a 5,1 ± 0,6 nM, respectivamente), y una concentración máxima ligeramente reducida activación relativa a la fosforilación inducida por HGF (74,8 % ± 0,4 % frente a 101,3 % ± 0,1 %, respectivamente). Por el contrario, el injerto de aMD4 en otros bucles resultó en una menor activación de Met en relación con el péptido del dímero aMD4. En el caso de aMD5, B1 fue el mejor sitio de injerto, donde Fc(aMD5)B1 activó Met con una EC50 3,7 veces mayor en comparación con el péptido dímero aMD5 no injertado, y una activación máxima ligeramente inferior (EC50: 16,6 ± 1,6 nM frente a 4,5 ± 0,2 nM, respectivamente, máxima activación: 76,2% ± 1,4% vs 105,0% ± 4,2%, respectivamente, Fig. 1c). Injertar aMD5 en otros bucles redujo o eliminó la activación de Met. En particular, las actividades agonistas de Fc injertado con lazo se correlacionaron bien con sus fuerzas de unión a la superficie celular Met (Fig. 1a complementaria) o fragmento de ectodominio Met (MetECD) (Datos extendidos Fig. 2 y Fig. 1b complementaria), lo que indica que sus eficacias están determinados en gran medida por su afinidad con Met. La diferencia en la dependencia del sitio de injerto de los dos péptidos probablemente se deba a los efectos estéricos impuestos por la diferencia en su sitio de unión en el ectodominio Met y sus arreglos espaciales divergentes en la estructura Fc (Fig. 2 complementaria).

Para mejorar la actividad agonista, agregamos un residuo de Cys en cada extremo de la secuencia aMD4 para promover una conformación macrocíclica estrechamente cerrada a través del enlace disulfuro (Fig. 2a y Fig. 3 complementaria). Los derivados con enlaces disulfuro aMD4 (en lo sucesivo con el prefijo 'ds') en T1 y B3 mostraron una mayor activación máxima de Met que el control (T1, P = 0.039; B3, P < 0.0001), mientras que no se observaron efectos en el EC50 (Suplementario Fig. 3f) y valores de constante de disociación (KD) de la unión MetECD (datos extendidos Fig. 2). Por el contrario, dsB2 no mostró ninguna mejora en la actividad agonista, la activación máxima o los valores de EC50 (Fig. 3f complementaria), lo que sugiere que la afinidad por Met reducida después del injerto en estos dos sitios no se debió a una conformación subóptima del motivo peptídico injertado per se. Esto fue respaldado aún más por las conformaciones similares de aMD4 o aMD5 cuando se injertaron en la posición B1 o B3 (Fig. 2 complementaria).

a, Activación celular de Met, medida por fosfo-Met (Tyr1234/1235), inducida por Fc(aMD4)B3, Fc(aMD4ds)B3 y HGF en células EHMES-1. Los resultados se muestran como media ± sem (n = 3 experimentos independientes). b–g, la respuesta de hepatocitos inducida por Fc(aMD4)B3 es comparable a la inducida por HGF. b, Señalización celular en hepatocitos humanos tratados con HGF, Fc(aMD4)B3 o control Fc (100 nM). Los lisados ​​se analizaron mediante transferencia Western. c, Matrices de tirosina quinasa de fosforreceptores que muestran la selectividad de Fc(aMD4)B3 por Met. Se estimularon hepatocitos humanos con HGF, Fc(aMD4)B3 o Fc. d – g, perfiles de expresión génica similares en esferoides de hepatocitos humanos primarios inducidos por Fc (aMD4) B3 y HGF. d, Esquema de inducción y estimulación de esferoides de hepatocitos por HGF o Fc(aMD4)B3. Se muestra una imagen representativa. Barra de escala, 200 µm. e, Un diagrama de dispersión que muestra la correlación entre los cambios de expresión génica inducidos por HGF y Fc(aMD4)B3 a las 24 h. La línea punteada azul indica la línea de regresión. f, Mapa de calor de DEG de esferoides de hepatocitos tratados con HGF o Fc (aMD4) B3 en relación con esferoides de hepatocitos no tratados (n = 2 por grupo, tasa de descubrimiento falso (FDR) <0.05, Benjamini-Hochberg, dos caras). g, Términos GO representativos significativamente enriquecidos y sus mapas de calor para DEG de esferoides de hepatocitos tratados con HGF o Fc (aMD4) B3 en relación con los controles no tratados (24 h, FDR <0.05, Benjamini-Hochberg, dos caras).

Datos fuente

Las respuestas celulares inducidas por Fc(aMD4)B3 en células EHMES-1 o en hepatocitos fueron muy comparables a las de HGF (Fig. 2 y Datos ampliados Fig. 3). Fc (aMD4) B3 a 1 nM indujo la fosforilación de Met en Y1234/1235 y activó la señalización posterior posterior con la fosforilación de Akt y Erk1/2 a niveles comparables a los inducidos por HGF (Fig. 2b y Fig. 4 complementaria). Los niveles de fosforilación inducidos por Fc(aMD4)B3 y HGF en tres residuos de tirosina diferentes de Met, así como la cinética de inducción de la fosforilación de Met, Akt y Erk1/2, fueron comparables (Datos ampliados Fig. 3). La selectividad de Fc (aMD4) B3 para Met se confirmó mediante una encuesta de fosforilación de tirosina de 49 receptores (Fig. 2c y Fig. 5 complementaria). Los cambios en la expresión génica inducidos por Fc (aMD4) B3 o HGF se examinaron en cultivos de esferoides de hepatocitos humanos primarios mediante RNA-seq (Fig. 2d-g). Un diagrama de dispersión muestra la correlación de los cambios en la expresión génica inducidos por HGF y Fc (aMD4) B3 en relación con los esferoides no tratados (Fig. 2e). Por último, un mapa de calor de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) en relación con esferoides no tratados indica que tanto Fc (aMD4) B3 como HGF alteraron de manera similar la expresión de más de 2000 transcritos (Fig. 2f), con un enriquecimiento significativo de la ontología génica (GO) términos relacionados con la cicatrización de heridas y las funciones hepáticas (Fig. 2g).

Como los péptidos generados de novo podrían unirse diferencialmente a los receptores objetivo de una manera completamente diferente a la de los ligandos nativos, teóricamente podríamos generar agonistas que no compitan con los ligandos nativos o que sean capaces de activar receptores mutados que carecen de unión a ligando. Para investigar este potencial, primero mapeamos el sitio de unión putativo de Fc (aMD4) B3 (que se muestra en rojo en la Fig. 3a) usando fragmentos MetECD quiméricos que fusionaron MetECD humano y de ratón de forma variable (Datos extendidos Fig. 4), explotando la especificidad de aMD4 para Met40 humano. El sitio de unión putativo está mapeado en la cara inferior del dominio Sema de Met, que no se superpone con el sitio de unión de HGF41, lo que explica por qué el péptido aMD4 no compite con la activación de Met inducida por HGF40.

a, Residuos esenciales (rojo) y auxiliares (naranja) para la unión de Fc(aMD4)B3 en el dominio Sema (PDB ID: 1shy). El dominio SP de HGF se muestra en amarillo. Se reunió la estructura del ectodominio de los modelos predichos (PDI ID: 1ux3 para Sema a IPT1, 2cew para IPT2 a IPT4). b, formación de dímero Met por Fc (aMD4) in vitro. Los complejos entre MetECD y Fc (aMD4) o Fc de control se entrecruzaron con BS3 y se analizaron con SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se tiñeron con plata. c – f, imágenes HS-AFM secuenciales representativas de Fc (aMD4) B3 (c), MetECD (d) y complejos 2: 1 de dímero Met inducidos por Fc (aMD4) B3 (e, f). Las interpretaciones esquemáticas de las imágenes HS-AFM se muestran en e y f (paneles superiores). Las puntas de flecha indican el dominio Sema. La purificación del complejo se muestra en Datos extendidos Fig. 5c. Se observaron al menos cinco moléculas o complejos para cada muestra. Los colores (de negro a blanco) corresponden a alturas crecientes de las moléculas. Barras de escala, 20 nm. Estos experimentos se repitieron de forma independiente dos veces, dando resultados comparables.

A continuación, examinamos la estructura del dímero Met inducido por Fc (aMD4). Los complejos entre MetECD y Fc (aMD4) se estabilizaron mediante la reticulación con bis (sulfosuccinimidil) suberato (BS3) y se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (Fig. 3b y Extended Data Fig. 5a, b). Los resultados indicaron la formación de complejos entre MetECD y Fc(aMD4) en estequiometría 1:1 o 2:1. La eficacia relativa de varios Fc(aMD4) en la formación de un complejo de señalización 2:1 fue del orden de B3 > B1 > B2, lo que se correlacionó bien con su capacidad para activar Met celular. El complejo 2:1 reticulado con BS3 de MetECD y Fc(aMD4)B3 se purificó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (Datos ampliados, Fig. 5c) y se sometió a examen de una sola molécula mediante microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM)42, con Fc y MetECD como controles (Fig. 3c-f y Videos complementarios 1-4). En HS-AFM, MetECD mostró un dominio Sema globular y dominios de tallo de factores de transcripción (IPT) similares a Ig, plexinas, con el posicionamiento relativo de cada dominio IPT siendo flexible (Fig. 3d y Video complementario 2). Fc (aMD4) B3 se unió a la cara inferior del dominio Sema y unió dos moléculas Met mientras se rociaban los dominios del tallo de IPT (Fig. 3e y Video complementario 3) o se adjuntaban (Fig. 3f y Video complementario 4). La flexibilidad de los dominios IPT probablemente permita la adecuada asociación de los dominios quinasas intracelulares de dos moléculas de Met, siendo esta asociación esencial para la activación de Met33,34. Estos resultados muestran que mientras Fc(aMD4)B3 se une a Met en un sitio diferente al del HGF, su reclutamiento de dos receptores de Met muy próximos le permite activar Met en la misma medida que HGF.

Las vidas medias largas de Fc y anticuerpos se mantienen principalmente a través de su unión a FcRn43,44,45,46. Como tal, hemos injertado con lazo selectivamente en ubicaciones de bucle que son distales del sitio de unión de FcRn (Fig. 4a). En consecuencia, nuestro análisis de la cinética de unión entre Fc (aMD4) y ​​FcRn inmovilizado mostró que el injerto de lazo en la mayoría de los bucles no afectó la afinidad de Fc por FcRn, aunque Fc (aMD4) T2 y M2 exhibieron valores KD ligeramente más altos que el control Fc ( Fig. 4b y Datos extendidos Fig. 6). Esto sugiere que el injerto de lazo en Fc conserva la afinidad de Fc con FcRn.

a, Los bucles insertados con péptido (T1 a B3) en Fc (gris) están diseñados lejos del sitio de unión a FcRn (naranja) y β2-microglobulina (β2M, amarillo) (PDB ID: 4N0U). b, valores KD de Fc y Fc(aMD4) a FcRn/β2M determinados por resonancia de plasmón superficial. Los resultados se muestran como media ± sem (duplicados de 3 concentraciones de analitos; prueba t de dos colas no apareada). c,d, Fc(aMD4)B3 mostró una semivida sérica prolongada en ratones. A ratones C57BL/6 de tipo salvaje (c) o ratones mFcRn-/- hFcRn+ (d) se les administró una única inyección de una cantidad equimolar por kg de Fc (0,7 mg kg-1), Fc(aMD4)B3 (0,74 mg kg −1) o HGF (1,0 mg kg−1) a través de la vena de la cola, y las concentraciones séricas se determinaron mediante ELISA. Los resultados se muestran como valores individuales (n = 6 ratones por grupo) (c) o media ± sem (d) (n = 10 ratones por grupo). Para HGF, algunas muestras estuvieron por debajo del límite de detección. e–j, Actividad in vivo de Fc(aMD4)B3 en ratones con hígado humanizado (ratones PXB). e, esquema. f, g, Síntesis de ADN replicativo. f, Imágenes representativas que muestran la tinción de BrdU en el hígado de ratones tratados con Fc(aMD4)B3 o PBS. Barra de escala, 100 µm. g, Porcentaje de células BrdU+ en el hígado. Los resultados se presentan como media ± sem (n = 4 ratones por grupo; prueba t de dos colas no apareada). h–j, Perfiles de expresión génica. h, Mapa de calor de DEG entre hígados de ratones PXB tratados con Fc (aMD4) B3 y tratados con PBS (n = 4 ratones por grupo, FDR < 0,01, Benjamini-Hochberg, dos caras). i, j, términos GO enriquecidos representativos en términos de enriquecimiento de veces (i) o número de genes (j) para DEG de hígados tratados con Fc (aMD4) B3 en relación con el control tratado con PBS (FDR < 0.01, Benjamini-Hochberg, dos -lado).

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A continuación, evaluamos la vida media en suero de Fc (aMD4) B3 en comparación con las de Fc y HGF de control en ratones de tipo salvaje después de una única administración intravenosa (iv) en una cantidad equimolar por kg (Fig. 4c). La concentración sérica de HGF disminuyó por debajo de 0,01 nM en 1 h, lo que no pudo activar Met. Por el contrario, Fc (aMD4) B3 mostró una vida media prolongada comparable a la del control Fc (Fig. 4c). Para determinar con precisión la farmacocinética de nuestras variantes basadas en Fc humano, medimos las vidas medias en suero de Fc (aMD4) B3 y Fc de control en ratones mFcRn-/- hFcRn+47 (Fig. 4d). La semivida sérica de Fc(aMD4)B3 en estos ratones fue de 49,4 h y comparable a la del control Fc (46,6 h). La concentración sérica de Fc(aMD4)B3 se mantuvo por encima de 1 nM, la concentración mínima para activar Met (Fig. 2a,b), hasta 200 h después de una única administración iv de 0,74 mg kg−1 (Fig. 4d).

A continuación, se examinó la actividad in vivo de Fc(aMD4)B3 usando ratones quiméricos trasplantados con hepatocitos humanos con aproximadamente el 80 % de los hepatocitos humanizados (ratones PXB)48, ya que Fc(aMD4)B3 es incapaz de activar Met40 murino. Primero confirmamos la vida media sérica extendida de Fc (aMD4) B3 en ratones PXB después de una sola inyección iv o subcutánea (sc) a 5 mg kg−1 (Fig. 6 complementaria). Posteriormente, se analizaron la proliferación y la expresión génica de los hepatocitos humanos 46 h después de una sola inyección sc de Fc (aMD4) B3 o PBS en ratones PXB (Fig. 4e-j). Fc (aMD4) B3 aumentó significativamente la síntesis de ADN replicativo de los hepatocitos en comparación con los ratones de control tratados con PBS (3,73 % ± 0,31 % frente a 0,37 % ± 0,07 %, respectivamente, P < 0,0001) (Fig. 4f, g). Un mapa de calor de DEG entre hígados tratados con Fc (aMD4) B3 y tratados con PBS indicó que Fc (aMD4) B3 alteró la expresión de más de 3200 transcripciones (Fig. 4h). Los términos GO significativamente enriquecidos entre ellos estaban principalmente involucrados en la replicación del ADN mitótico / ciclo celular y procesos metabólicos (Fig. 4i, j). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que el injerto de lazo generó una Fc activadora de Met que es bioactiva in vivo, con una vida media marcadamente mejorada que es comparable a la de la Fc no modificada.

Se ha informado que la activación de Met inducida por HGF ejerce efectos neuroprotectores beneficiosos en modelos preclínicos de isquemia cerebral, lesiones de la médula espinal y patologías neurológicas, como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y la esclerosis múltiple35. De acuerdo con estudios anteriores, confirmamos que Met se expresa en neuronas en cerebros de ratones (Fig. 7 complementaria). Para generar agonistas de Met capaces de cruzar la BBB, aplicamos injerto de lazo de aMD4 en la Fc del anticuerpo anti-TfR de ratón (mTfR)49 en configuración de Fab simple o doble (sTfR(aMD4) y ​​dTfR(aMD4), respectivamente) (Fig. 5a, b y Fig. 8 complementaria). El injerto de lazo no alteró significativamente la afinidad reportada previamente9,10 de estos anticuerpos por mTfR, lo que sugiere que la afinidad de Fab se conserva en gran medida (Fig. 5c). Por el contrario, tanto sTfR(aMD4) como dTfR(aMD4) mostraron una activación de Met reducida en comparación con Fc(aMD4), con una reducción de 9,6 y 18,7 veces en los valores de CE50 (20,2 ± 3,4 nM frente a 39,2 ± 22,3 nM frente a 2,1 ± 0,2 nM , respectivamente) (Fig. 5d). Esto posiblemente se debió a la presencia de brazos Fab grandes en sTfR (aMD4) y ​​dTfR (aMD4), que pueden haber interferido con su unión y/o dimerización de Met en la superficie celular.

a, Representaciones esquemáticas de Fc(aMD4), dTfR(aMD4) y ​​sTfR(aMD4). Todas las variantes se injertaron con aMD4ds en el bucle B3 de IgG Fc humana. El Fab del receptor de transferrina anti-ratón de rata se fusionó con Fc (aMD4). b, SDS-PAGE de variantes purificadas. c, el injerto de lazo de aMD4 en anticuerpos anti-TfR conservó la afinidad por TfR. Los valores aparentes de KD (en nM) de Fc (aMD4), sTfR (aMD4) y ​​dTfR (aMD4) para TfR de ratón (mTfR) se determinaron mediante ELISA y se presentan como media ± sd (n = 3 experimentos independientes). d, activación de Met celular por anticuerpos anti-TfR injertados con aMD4. Las células EHMES-1 se trataron con Fc (aMD4), sTfR (aMD4) o dTfR (aMD4). La activación celular de Met se cuantificó in situ con anticuerpo anti-fosfo-Met (Tyr1234/1235) y se presentó como media ± desviación estándar (n = 3 experimentos independientes). Se indican los valores de EC50 (en nM). e–j, penetración BBB de anticuerpos anti-TfR injertados con aMD4. Esquema (e), concentración cerebral (f), porcentaje de dosis inyectada por gramo de cerebro (g), concentración sérica (h) y relación cerebro-suero (i) a las 24 h después de una inyección única de Fc (aMD4), sTfR(aMD4) o dTfR(aMD4) en cantidad equimolar por kg (12, 20 y 26,5 mg kg−1, respectivamente) a través de la vena de la cola. Los resultados se muestran como media ± sem (n = 4 ratones por grupo; prueba t de dos colas no apareada). j, Imágenes representativas de tinción inmunohistoquímica de secciones de cerebro de ratones a las 24 h después de una inyección única de Fc (aMD4), sTfR (aMD4) o dTfR (aMD4) a través de la vena de la cola. Tenga en cuenta la amplia tinción de sTfR (aMD4) en el parénquima cerebral y la localización alrededor de los cuerpos celulares neuronales positivos para NeuN. La tinción para dTfR (aMD4) fue más prominente en las células endoteliales que en los cuerpos celulares neuronales. Barras de escala, 50 µm.

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Por último, examinamos la penetración de BBB de las tres variantes injertadas de aMD4 en ratones de tipo salvaje después de una sola administración iv en dosis terapéuticamente relevantes de las proteínas en una cantidad equimolar por kg (Fig. 5e-j). Sus concentraciones en cerebros o suero perfundidos con PBS a las 24 h después de la inyección iv se determinaron mediante ELISA para IgG Fc humana. De las tres variantes, sTfR(aMD4) mostró el mayor porcentaje de dosis inyectada por gramo de cerebro (0,96 % ± 0,07 %), la relación cerebro-suero (8,3 % ± 0,7 %), así como la concentración cerebral más alta (10,7 ± 1.2 nM) (Fig. 5f-i), que es suficiente para la activación de Met (Fig. 5d). Estos resultados están en línea con informes previos de acumulación de anticuerpos anti-TfR de baja afinidad en el cerebro9,10,50. En comparación, estos valores fueron significativamente más bajos para dTfR (aMD4) y ​​fueron casi insignificantes en Fc (aMD4) (Fig. 5f-i). De acuerdo con la concentración cerebral más alta determinada por ELISA, sTfR (aMD4) mostró una tinción parenquimatosa prominente co-localizada con NeuN, GFAP e Iba1, lo que indica su distribución en neuronas, astrocitos y microglia, respectivamente (Fig. 5j (centro a la derecha) y Fig. Suplementaria . 9). En comparación, dTfR (aMD4) mostró una tinción neuronal menos extensa y más tinción endotelial (Fig. 5j (derecha)), en línea con informes anteriores de acumulación de anticuerpos anti-TfR de alta afinidad en células endoteliales cerebrales9,10. Por último, Fc (aMD4) fue indetectable en el parénquima cerebral (Fig. 5j (centro izquierda)). Se necesitará una evaluación adicional de los perfiles farmacocinéticos detallados, incluido el curso del tiempo, para la futura evaluación terapéutica de sTfR (aMD4) en modelos preclínicos. Tomadas en conjunto, estas observaciones mostraron que hemos generado agonistas de Met que penetran en BBB mediante el injerto de lazo de péptido macrocíclico de unión a Met en la Fc del anticuerpo anti-mTfR.

El injerto de péptidos identificados de novo para mejorar su estabilidad y biodisponibilidad se ha intentado en una variedad de andamios23,24,25,26. Estos estudios anteriores revelaron que el éxito del injerto depende en gran medida de la combinación y la compatibilidad entre los péptidos injertados y las proteínas del armazón25,26. Como tal, la selección de la proteína de andamio es una consideración clave, ya que determina el éxito del injerto de péptidos al mismo tiempo que confiere propiedades deseables como la estabilidad metabólica y la permeabilidad celular a los productos de ingeniería24,25,26. Para satisfacer este amplio espectro de características deseables, se han diseñado péptidos y miniproteínas estabilizados con disulfuro para que actúen como andamios especializados para el injerto de péptidos23,24,25,26. Sin embargo, estos andamios especializados son pequeñas proteínas no humanas sin bioactividades particulares propias. Aunque las proteínas humanas naturales son andamios deseables para el injerto de péptidos, hasta ahora ha habido intentos muy limitados de injertar péptidos identificados de novo en andamios humanos naturales. Una de las principales razones detrás de esto es que el injerto de péptidos sintéticos identificados de novo en un dominio plegado de forma independiente de un andamio natural a menudo daría como resultado el plegamiento incorrecto y la inactivación de ambas entidades. Por lo tanto, es notable que nuestros datos hasta el momento indiquen que el injerto funcional de péptidos macrocíclicos identificados de novo en los bucles de proteínas de andamios naturales es mucho más factible de lo que se esperaba previamente27,28,29.

Como andamio de proteína, la Fc es muy deseable debido a su alta expresión, facilidad de fabricación, larga vida media y compatibilidad con Fab5,6,31,32. En este estudio, informamos que el injerto de lazo Fc con péptidos macrocíclicos produjo agonistas del receptor Met con vida media prolongada y penetración de BBB. Nuestra aplicación de injerto de lazo en Fc ha revelado tres fortalezas clave para este enfoque: en primer lugar, el injerto de lazo conservó las características bioquímicas generales de Fc en términos de nivel de expresión, afinidad de FcRn y compatibilidad de Fab. En segundo lugar, el péptido macrocíclico injertado con lazo conservó en gran medida la conformación macrocíclica parental incluso sin enlace disulfuro. En tercer lugar, existe una amplia variedad de posiciones de inserción adecuadas en Fc. Nuestro estudio mostró además que la afinidad por el objetivo de los péptidos injertados depende del sitio. Por ejemplo, los bucles en T fueron menos efectivos en nuestro estudio, probablemente debido a la presencia de una región bisagra en el extremo N que podría interferir con la unión de los péptidos injertados a la proteína objetivo, Met. Sin embargo, estos bucles actuaron como posiciones de injerto adecuadas para otros aglutinantes de receptores27,29. A pesar de esto, la robusta compatibilidad de injerto entre péptidos macrocíclicos y Fc, en combinación con una amplia variedad de posiciones de inserción, hace que el injerto de lazo sea un enfoque particularmente eficaz de la ingeniería de Fc.

Una implicación importante de nuestros hallazgos es que los andamios de proteínas de injerto de lazo con propiedades específicas pueden servir como marco para diseñar agonistas de receptores de diseño con las propiedades deseadas en función de la elección de los andamios de proteínas. Como demostración de esto, generamos agonistas permeables a BBB injertando con lazo un anticuerpo anti-TfR, aprovechando así una técnica establecida de permeación de BBB8,9,10. En la actualidad, hay varios esfuerzos para desarrollar anticuerpos de fusión Fab anti-TfR con propiedades bloqueantes, pero solo unos pocos intentan desarrollar anticuerpos agonistas51. El injerto de lazo podría usarse para diseñar anticuerpos agonistas que penetran BBB, además de los antagonistas. Además, un inconveniente importante de los anticuerpos que atraviesan BBB actuales es que, debido a su baja proporción de cerebro a suero y su larga vida media en circulación, las concentraciones sistémicas a menudo exceden el rango deseado durante períodos prolongados. Esto podría causar neoinmunogenicidad no deseada o efectos secundarios, especialmente si la molécula objetivo es funcionalmente importante en otros tejidos. Con el injerto de lazo, esto podría evitarse mediante el injerto de péptidos funcionales directamente en proteínas de andamiaje con una vida media corta, como el Fab anti-TfR.

Contrariamente a los métodos existentes que mejoran la farmacocinética de las proteínas terapéuticas mediante la modificación de la proteína, el injerto de lazo otorga funciones novedosas derivadas de péptidos pequeños a andamios de proteínas bien conocidos27,28,29, por lo que evita posibles peligros como actividad biológica reducida, características proteicas desfavorables para la fabricación o neoinmunogenicidad derivada de la fusión de proteínas o del poli(etilenglicol)5,6,7. Aunque Fc sirve como un andamio excelente debido a su propiedad inmunosupresora52, la inmunogenicidad, la seguridad y la eficacia de las proteínas injertadas con lazo esperan una evaluación futura como parte del desarrollo de fármacos. En la misma línea, el HGF ha mostrado eficacias terapéuticas en modelos preclínicos de diversas enfermedades como la esteatohepatitis no alcohólica53,54 o patologías neurológicas35,37. Las ventajas terapéuticas de los agonistas Met injertados con lazo generados en este estudio también deben evaluarse más a fondo en modelos de enfermedades.

En vista de los rápidos avances en potentes péptidos macrocíclicos bioactivos y compatibles con injertos, el injerto de lazo es muy prometedor para la generación de terapias de proteínas de diseño con la estabilidad fisicoquímica y la farmacocinética deseadas, así como para la ingeniería de proteínas y anticuerpos multifunción.

Para diseñar la proteína Fc injertada con péptido, se inspeccionó estructuralmente la proteína Fc para encontrar un punto de inserción apropiado en el que la distancia aproximada entre los dos residuos del punto de anclaje ubicados dentro de un bucle expuesto fuera inferior a 7 Å. Para la construcción de control o Fc injertado con péptido macrocíclico de unión a Met (aMD4 o aMD5), se usó IgG1 Fc humana (residuos 104–330, Uni-Prot P01857) sin etiquetas. La secuencia interna de aMD4 o aMD5 adjunta con o sin Cys y dos residuos espaciadores de Gly en ambos extremos se insertaron en estos sitios identificados (T1 a B3). Para la construcción de anticuerpos anti-TfR de ratón con inserción de aMD4ds en el sitio B3, se utilizó el fragmento Fab de un anticuerpo monoclonal de rata anti-TfR de ratón (clon 8D3)49. El fragmento VH a CH1 de 8D3 se fusionó con el extremo N de Fc(aMD4) para producir la cadena pesada (HC) de dTfR(aMD4). El fragmento VL a CL de 8D3 se usó para producir la cadena ligera (LC). Para la construcción de sTfR (aMD4), se agregó una etiqueta de bandera en el extremo N de Fc (aMD4). Las secuencias de aminoácidos utilizadas para s/dTfR(aMD4) se pueden encontrar en la Fig. 8 complementaria. Todas las construcciones de expresión se realizaron utilizando un esqueleto basado en pcDNA3.1 con el péptido señal apropiado y la región codificante de todas las construcciones de expresión se verificó mediante secuenciación de ADN. . Las expresiones de proteínas se realizaron utilizando el sistema de expresión Expi293 (Thermo Fisher). Las proteínas secretadas se purificaron en una columna HiTrap Protein A HP (Cytiva) mediante elución con tampón de citrato de sodio y ácido citrato 0,1 M (pH 3,5), seguida de neutralización, diálisis contra solución salina tamponada con fosfato (PBS) y cromatografía de exclusión por tamaño en un Superdex Columna de 200 aumentos 10/300GL (Cytiva) equilibrada con PBS. El análisis SDS-PAGE y la pureza de las variantes de Fc purificadas utilizadas en el ensayo se pueden encontrar en la Fig. 10 complementaria. Para la expresión y purificación de sTfR (aMD4), tres ADN (TfR (aMD4) HC, TfR (aMD4) LC y Fc (aMD4)) para cotransfectar células Expi293F, produciendo la mezcla de sTfR (aMD4), dTfR (aMD4) y ​​Fc (aMD4). El sTfR(aMD4) se purificó a partir de los dos últimos componentes mediante purificación de afinidad anti-Flag secuencial y cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superdex 200 Increment 10/300GL equilibrada con PBS.

Se sembraron células de mesotelioma humano EHMES-1 a razón de 8000 células por pocillo en una placa µClear negra de 96 pocillos (Greiner Bio-One) y se cultivaron en medio RPMI1640 suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 % durante 24 h. Las células se estimularon con cada proteína en medio RPMI1640 suplementado con FBS al 10 % durante 10 min o el tiempo indicado, se lavaron con PBS helado, se fijaron con paraformaldehído al 4 % en PBS durante 30 min, se lavaron con PBS y se bloquearon con suero de cabra al 5 % y Triton X-100 al 0,02 % en PBS durante 30 min. La fosforilación de Met, Akt o Erk1/2 se detectó usando un anticuerpo anti-fosfo-Met (Tyr1234/1235) (dilución 1:1000, D26, Cell Signaling Technologies), Akt fosforilado (S473) (dilución 1:1000, D9E, Cell Signaling Technology) o Erk1/2 fosforilado (T202/Y204) (dilución 1:1000, D13.14.4E, Cell Signaling Technology) y un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1:1000, dako). Luego, se midió la quimioluminiscencia desarrollada con el reactivo ImmunoStar LD (Wako) utilizando un lector de placas ARVO MX (Perkin Elmer).

La unión de proteínas Fc injertadas con péptido a células CHO knockout para Met y células CHO reconstituidas con Met27 se detectó mediante citometría de flujo. Las células se separaron de las placas mediante un breve tratamiento con tripsina al 0,25 % y ácido etilendiaminotetraacético 1 mM, se sembraron en placas a razón de 200 000 células por pocillo y se incubaron con proteínas Fc injertadas con péptido diluidas a 10 mg ml-1 en 100 ml de medio Ham's F-12 que contenía un 5 %. FBS en hielo durante 1,5 h. Después de lavar dos veces con PBS enfriado con hielo, las células se incubaron con IgG antihumana de cabra marcada con Alexa Fluor 488 (dilución 1:400 en 100 µl de medio Ham's F-12 que contenía 5 % de FBS, Thermo Fisher, A11013) en hielo durante 30 min, luego analizado en un sistema EC800 (Sony). La puerta en la dispersión frontal frente a la dispersión lateral se configuró para incluir todas las poblaciones de células, pero excluyendo los desechos y las células muertas, como se muestra en la Fig. 11 complementaria. Los datos se analizaron con el software FlowJo (Tomy Digital Biology).

El fragmento de ectodominio de Met humano (MetECD, 1–931) se fusionó en el extremo C con una secuencia aceptora de biotina (SSLRQILDSQKMEWRSNAGG) y se coexpresó con una biotina ligasa (BirA) en células Expi293F para lograr la biotinilación biosintética mediada por BirA y se inmovilizó en un chip Biotin CAPture Serie S (Cytiva) con una densidad de superficie de ~210 unidades de resonancia (RU). La unión de Fc y Fcs injertadas con péptido se evaluó inyectando las soluciones de analito diluidas en serie usando el tampón de funcionamiento (HEPES-NaOH 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05 %). Las corridas se realizaron en modo cinético de ciclo único empleando los siguientes parámetros: velocidad de flujo de 30 µl min−1, tiempo de contacto de 120 s y tiempo de disociación de 300 s. Después de cada ejecución, la superficie se regeneró inyectando el tampón de regeneración (guanidina-HCl 6 M, NaOH 250 mM) hasta que la respuesta volvió al nivel inicial original. Las curvas de unión se obtuvieron restando la RU de la celda de referencia (no inmovilizada) de la de la celda de medición (inmovilizada con MetECD) y se usaron para derivar los valores de unión cinética. Los datos se obtuvieron con un instrumento Biacore T200 (Cytiva) a 25 °C y los resultados se analizaron con el software de evaluación Biacore T200 v3.2 (Cytiva). Se capturó FcRn/β2M humano biotinilado (ACROBiosystems) en la superficie de chips recubiertos con estreptavidina (Cytiva) a 180~220 RU. Los analitos se diluyeron en tampón de funcionamiento (fosfato 50 mM (pH 6,0), NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,01 %) y se inyectaron a razón de 30 µl min−1 durante 1 min, seguido de disociación durante 0,7 min. Las curvas de unión se obtuvieron restando la RU de la celda de referencia (no inmovilizada) de la de la celda de medición (inmovilizada con FcRn/2M) y después de la puesta a cero del eje, los sensogramas se ajustaron localmente a un modelo de unión Langmuir 1:1. Los datos se obtuvieron con un instrumento Biacore 3000 (Cytiva) a 25 °C y los resultados se analizaron con el software BIAe Evaluation v4.1 (Cytiva).

Las estructuras del dominio CH3 de Fc con aMD4 o aMD5 insertado en el bucle B1 o B3 se predijeron utilizando ColabFold y AlphaFold2 en MMseqs255.

La digestión con tripsina y el análisis LC-MS/MS fueron realizados por KANEKA TECHNO RESEARCH. Se trataron cien µg de Fc(aMD4ds)T1 o Fc(aMD4ds)B3 en PBS con bicarbonato de amonio 100 mM (Sigma-Aldrich) que contenía urea 8 M (Fujifilm Wako Pure Chemicals). Después de desalinizar con un dispositivo Amicon Ultra (MWCO: 10 K, Millipore), se digirieron 10 µg de cada proteína con tripsina (Promega) durante 12 h a 37 °C en condiciones no reductoras. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido fórmico. Las muestras se inyectaron en un sistema UHPLC Nexera X2 (Shimadzu Corporation) conectado a un sistema SCIEX TripleTOF 6600 (AB SCIEX) equipado con una fuente de ionización ESI. Los péptidos se separaron cromatográficamente en una columna de fase inversa C18 con gradiente lineal de fase móvil A (agua que contenía 0,1 % de ácido fórmico) y fase móvil B (acetonitrilo (Fujifilm Wako Pure Chemicals) que contenía 0,1 % de ácido fórmico). Los datos de MS y MS/MS se recopilaron usando IDA, modo de iones positivos. Los datos sin procesar de LC-MS se procesaron con el software SCIEX BioPharmaView. Se usaron los siguientes criterios para identificar péptidos: la precisión de masa para el precursor emparejado debe estar dentro de 5 ppm del error de masa, y la puntuación de coincidencia de péptidos se fijó en al menos 3 para la identificación de péptidos.

Se mezclaron MetECD (60 nM) y Fc(aMD4)B1/B2/B3 (20 nM) en 100 µl de PBS con Triton X-100 al 0,01 % durante 1 h. Las muestras se dividieron en dos y se trataron con BS3 1 mM (Thermo Fisher) o se dejaron sin tratar durante 1 h, se extinguieron con Tris 50 mM, se sometieron a SDS-PAGE (gel al 7,5 % o al 3–10 %) y se tiñeron con plata. Para la observación de HS-AFM, MetECD (2,6 µM) y Fc(aMD4)B3 (1,3 µM) se mezclaron en 100 µl de PBS con Triton X-100 al 0,01 % durante 1 h, se trataron con BS3 1 mM durante 1 h, se extinguieron mediante Tris 50 mM y analizado por cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 6 Increment 10/300GL (Cytiva) equilibrada con PBS. Las fracciones separadas se analizaron mediante SDS-PAGE y se tiñeron con azul brillante de Coomassie. Una sola fracción se sometió a análisis HS-AFM.

Las mediciones de HS-AFM se realizaron en modo tapping. La desviación del voladizo se detectó con un detector de desviación de haz óptico usando un láser infrarrojo (IR) (0,7 mW, 780 nm). El rayo láser IR se enfocó en la parte trasera de un voladizo cubierto con película de oro (Olympus, BL-AC10DS-A2) a través de una lente de objetivo ×60 (CFI S Plan Fluor ELWD ×60; Nikon). El reflejo del láser IR del voladizo se detectó utilizando un fotodiodo PIN de dos segmentos (MPR-1; Graviton). La amplitud de oscilación libre fue de aproximadamente 1 nm y la amplitud del punto de ajuste fue de aproximadamente el 90 % de la amplitud libre para el control de retroalimentación de HS-AFM. Para la sonda AFM, se utilizó una punta de carbono amorfo con una longitud de aproximadamente 500 nm cultivada por deposición de haz de electrones. Para el sustrato AFM, se utilizó una superficie de mica tratada con 3-aminopropil-trietoxisilano al 0,01% (Shin-Etsu Silicone). Todas las observaciones de HS-AFM se realizaron en una solución tampón que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) y NaCl 100 mM a temperatura ambiente.

Se obtuvieron monocapas de hepatocitos humanos primarios derivados de ratones quiméricos con hígado humanizado de PhoenixBio y se cultivaron en placas de 12 pocillos recubiertas con colágeno. Los hepatocitos se cultivaron en medio dHCGM que consistía en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con FBS al 10 %, HEPES 20 mM, NaHCO3 44 mM, antibióticos (100 U ml−1 de penicilina G y 100 µg ml−1 de estreptomicina), 15 µg ml− 1 l-prolina, 0,25 µg ml−1 de insulina, 50 nM dexametasona, 5 ng ml−1 de factor de crecimiento epidérmico, 0,1 mM de ácido l-ascórbico y dimetilsulfóxido al 2 % (todos los suplementos de PhoenixBio).

Se obtuvieron hepatocitos humanos crioconservados de Gibco. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos de unión ultrabaja (Nunclon Sphera, Thermo Fisher) a 1500 células viables por pocillo y, posteriormente, se centrifugaron a 200 × g durante 2 min. Las células se sembraron en 100 µl de medio Williams E suplementado con GlutaMAX 2 mM, 100 U ml−1 de penicilina, 100 µg ml−1 de estreptomicina, 4 µg ml−1 de insulina, 1 µM dexametasona, 15 mM HEPES (pH 7,4) y 10 % FBS (todos los suplementos de Levadura Oriental). A partir de los cinco días después de la siembra, cuando los esferoides estaban lo suficientemente compactos, se cambió el 50% del medio cada 2 días por medio Williams E libre de suero suplementado con GlutaMAX 2 mM, 100 U ml−1 de penicilina, 100 µg ml−1 de estreptomicina, 6,25 µg ml−1 insulina, 6,25 µg ml−1 transferrina, 6,25 µg ml−1 ácido selenoso, 1,25 mg ml−1 BSA, 5,35 µg ml−1 ácido linoleico, 100 nM dexametasona y 15 mM HEPES (pH 7,4) (todas suplementos de Levadura Oriental). Los esferoides se trataron en un medio sin suero con HGF 0,3 nM o Fc(aMD4)B3 30 nM los días 7 y 9. Se recolectaron cuarenta y ocho esferoides para cada grupo y se sometieron a aislamiento de ARN los días 8 o 10.

Los hepatocitos monocapa se privaron de suero en DMEM con BSA al 0,2 % durante 3 h, se estimularon con HGF (0,01~1 nM), Fc(aMD4)B3 (1~100 nM), Fc (100 nM) o sin estimular (Ninguno) en DMEM con Suero al 10% durante 10 min. Las células EHMES-1 se privaron de suero en RPMI1640 con BSA al 0,2 % durante 3 h, se estimularon con HGF (0,04~1,1 nM), Fc(aMD4)B3 (1,3~33 nM) o no se estimularon en RPMI1640 con BSA al 0,2 % durante 10 min. Estas células se lavaron con PBS helado y se lisaron en 400 µl de tampón de lisis (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 %, NP-40 al 1 %, glicerol al 10 %, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM, Na3VO4 mM, NaF 1 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM e inhibidores de la proteasa). Los lisados ​​se pasaron a través de una aguja 27G y un filtro de 0,45 µm y se centrifugaron. Las concentraciones de proteína de los lisados ​​se midieron mediante ensayo de ácido bicinconínico (Thermo Fisher). Los sobrenadantes se sometieron a transferencia Western para Erk1/2 fosforilado (T202/Y204) (dilución 1:1000, D13.14.4E, Tecnología de señalización celular), Erk1/2 (dilución 1:1000, 137F5, Tecnología de señalización celular), Erk1/2 (dilución 1:1000, 137F5, Tecnología de señalización celular), Akt (S473) (dilución 1:1000, D9E, tecnología de señalización celular), Akt (dilución 1:1000, 11E7, tecnología de señalización celular) o GAPDH (dilución 1:1000, 14C10, tecnología de señalización celular). Los sobrenadantes se sometieron a inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-Met (5 µg para 600 µl de lisados, D-4, Santa Cruz Biotechnology) y transferencia Western para Met (dilución 1:1000, D1C2, Cell Signaling Technology), Met fosforilada (Y1234 /Y1235) (dilución 1:1000, D26, Tecnología de señalización celular), Met fosforilado (Y1003) (dilución 1:1000, 13D11, Tecnología de señalización celular) o Met fosforilado (Y1349) (dilución 1:1000, 130H2, Tecnología de señalización celular ). Los blottings fueron seguidos por anticuerpo secundario conjugado con HRP (Dako) y medición de quimioluminiscencia desarrollada con reactivo ImmunoStar LD (Wako), utilizando el lector de imágenes FUSION-SOLO.6S.EDGE (VIRVER). Para la matriz fosfo-RTK, los hepatocitos se privaron de suero en DMEM con BSA al 0,2 % durante 3 h, se estimularon con HGF (1 nM), Fc(aMD4)B3 (100 nM), Fc (100 nM) diluidos en DMEM con 10 % suero durante 10 min, lavado con PBS helado, lisado en 400 µl de tampón de lisis 17 (R&D Systems) con cóctel inhibidor de proteasa (Nacalai Tesque), pasado a través de un filtro de 0,45 µm y centrifugado. Los lisados ​​(1 mg) se analizaron utilizando el kit Human Phospho-RTK Array (R&D Systems).

El ARN total de esferoides de hepatocitos o hígados tratados con RNAlater (Thermo Fisher) de ratones PXB se preparó utilizando el reactivo de lisis QIAzol (Qiagen) y se envió al laboratorio de bioingeniería (Kanagawa, Japón) para el control de calidad del ARN y la secuenciación del ARN en un DNBSEQ. -Secuenciador G400 (MGI Tech). Se prepararon bibliotecas de ADN complementarias para RNA-seq usando el conjunto de preparación de bibliotecas direccionales de ARN MGIEasy (MGI Tech) y se evaluaron usando el analizador de fragmentos AATI (Advanced Analytical Technologies). Las bibliotecas de ADNc se circularizaron con el kit de circularización MGIEasy (MGI Tech), se prepararon como nanobolas de ADN con el kit de secuenciación de alto rendimiento DNBSEQ-G400RS (MGI Tech) y se siguió con una secuenciación paralela masiva (2 × 100 pb) en un DNBSEQ-G400 secuenciador (MGI Tech). Después de excluir las secuencias adaptadoras usando cutadapt (ver. 1.9.1) y las secuencias con puntaje de baja calidad (<20) o menos de 40 nucleótidos usando la hoz (ver 1.33), las lecturas se alinearon con el genoma humano de referencia (GRCh38.p13) usando el software hisat2 (v2.2.0). Los datos de alineación se contaron utilizando featureCounts (ver. 2.0.0). La abundancia de transcripciones se midió en lecturas por kilobase de exón por millón de lecturas mapeadas (RPKM) y transcripciones por millón (TPM). El análisis DEG se realizó con DEGES en TCC (v1.18.0) y DESeq (v1.30.0) (FDR < 0,05 o < 0,01, Benjamini-Hochberg, bilateral). Todos los DEG identificados se sometieron a análisis de conglomerados utilizando Gene Cluster 3.0. Los términos GO significativamente enriquecidos se identificaron mediante el análisis de enriquecimiento GO de PANTHER.

Se determinó la vida media en suero de hasta 9 h en ratones C57BL/6 de tipo salvaje (hembra, 9 semanas, 18–21 g, obtenidos de Japan SLC) que recibieron una inyección única en la vena de la cola a 0,7 mg kg−1 para Fc , 0,74 mg kg-1 de Fc(aMD4)B3 y 1,0 mg kg-1 de HGF humano recombinante (Kringle Pharma), diluidos en 100 µl de PBS. Se determinó la vida media en suero hasta 12 días en ratones heterocigotos mFcRn-/- hFcRn Tg 276 (hembra, 9-12 semanas, 18-24 g) producidos internamente cruzando ratones mFcRn-/- y homocigotos hFcRn Tg 276 ratones obtenidos de Jackson Laboratory. A los ratones se les administró una única inyección en la vena de la cola a 0,7 mg kg-1 de Fc o 0,74 mg kg-1 de Fc(aMD4)B3 diluidos en 100 µl de PBS. También se determinó la vida media en suero hasta 12 días en ratones quiméricos con hígado humanizado (ratones PXB, PhoenixBio, macho, >12 semanas, 19–24 g) que recibieron una inyección única en la vena de la cola o una inyección subcutánea de 5,0 mg kg −1 para Fc(aMD4)B3, diluido en 100 µl de PBS. Se extrajo sangre de la vena submandibular utilizando una lanceta animal Goldenrod (Bio Research Center) o del plexo orbital en cada punto de tiempo, se procesó en suero y se almacenó a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones séricas de Fc y Fc(aMD4)B3 se determinaron utilizando un inmunoensayo de reconocimiento de inmunoglobulina humana (conjunto de cuantificación ELISA de IgG humana, Bethyl Laboratories). Las concentraciones séricas de HGF se determinaron utilizando un ELISA desarrollado internamente. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las pautas proporcionadas por la Conducta adecuada de experimentos con animales (1 de junio de 2006, Consejo científico de Japón). Los procedimientos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Kanazawa o el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de PhoenixBio.

Se generaron ratones quiméricos con hígados humanizados (ratones PXB, PhoenixBio) a partir de ratones con inmunodeficiencia combinada severa y activador de plasminógeno tipo uroquinasa trasplantados con hepatocitos humanos, con aproximadamente el 80 % de los hepatocitos humanizados48. A ratones PXB (macho, >12 semanas, 15–21 g) se les administró una única inyección subcutánea de 5 mg kg−1 de Fc(aMD4)B3 en 200 µl de PBS o PBS de control. Cuarenta y cuatro horas después de la administración de Fc(aMD4)B3 o PBS de control, se inyectó por vía intraperitoneal 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Sigma Chemical) en ratones quiméricos a una dosis de 100 mg kg−1 durante 2 h antes asesinato. Los hígados aislados de ratones PXB se trataron con RNAlater para RNA-seq o se prepararon para tinción con BrdU. Se incubaron secciones de parafina fijadas con formalina de hígados quiméricos con un anticuerpo anti-BrdU de rata a 3 µg ml−1 (Abcam, ab6326), seguido de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de rata conjugado con Alexa Fluor 488 a 1 µg ml−1 (Abcam, ab150157). Los núcleos se contrastaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Fisher) a 300 nM. Las imágenes fluorescentes se obtuvieron usando Keyence BZ-X810. El número de núcleos positivos para BrdU se determinó contando al menos 15.000 células en 20 campos visuales seleccionados al azar en secciones del lóbulo lateral izquierdo y el lóbulo medio derecho por animal. Los procedimientos que involucran tejidos hepáticos humanizados fueron aprobados por el Comité Ético de Utilización de Tejidos Humanos de PhoenixBio. Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con las pautas proporcionadas por la Conducta adecuada de experimentos con animales (1 de junio de 2006, Consejo científico de Japón). Los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Ética de Animales de Laboratorio de PhoenixBio.

Las placas MaxiSorp (Nunc) se recubrieron con TfR de ratón recombinante (2 µg ml−1 en PBS, 50 µl por pocillo, R&D Systems) a 4 °C durante la noche, se lavaron con Tween 20 al 0,05 % en PBS y se bloquearon con BSA al 1 % en PBS. . Las placas se incubaron con valoraciones en serie 1:3 de dTfR(aMD4), sTfR(aMD4) o Fc(aMD4) diluidas con Tween 20 al 0,05 % y BSA al 1 % en PBS a temperatura ambiente durante 1 h, lavadas con Tween 20 al 0,05 % en PBS, incubado con anticuerpo Fc IgG antihumano conjugado con HRP (0,5 µg ml−1, 100 µl por pocillo, Bethyl Laboratories) a temperatura ambiente durante 1 h y lavado con Tween 20 al 0,05 % en PBS. Las señales se generaron mediante incubación con sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Cell Signaling Technology) y la absorbancia se leyó con un lector de placas ARVO MX (Perkin Elmer).

A ratones C57BL/6 de tipo salvaje (hembra, 7–8 semanas, 17–20 g, obtenidos de SLC) se les administró una única inyección en la vena de la cola en una cantidad equimolar por kg: 26,5 mg kg−1 para dTfR(aMD4), 20,0 mg kg−1 para sTfR(aMD4) o 12,0 mg kg−1 para Fc(aMD4), diluidos en 200 µl de PBS. Veinticuatro horas después de la inyección, los ratones se anestesiaron y se extrajo sangre del ventrículo derecho y se procesó en suero. Se aislaron cerebros de ratones después de la perfusión con PBS a una velocidad de 2 ml min-1 durante 8 min. Cada mitad del cerebro se homogeneizó en NP-40 al 1% (Calbiochem) en PBS que contenía tabletas de cóctel de inhibidor de proteasa sin EDTA CompleteMini (Roche Diagnostics), se rotó a 4 °C durante 1 h, se centrifugó a 14 000 rpm durante 20 min y sobrenadantes recogidos. El suero y los lisados ​​de cerebro se sometieron a medición de anticuerpos utilizando un inmunoensayo de reconocimiento de inmunoglobulina humana (equipo de cuantificación ELISA de IgG humana, Bethyl Laboratories). Para calcular las concentraciones en el cerebro, se consideró que ng g−1 de cerebro era ng ml−1. Cada mitad del cerebro se incrustó en un compuesto de temperatura de corte óptimo (Sakura Finetek Japan), se congeló en nitrógeno líquido y se seccionó a 10 µm de espesor. Después de la fijación en paraformaldehído al 4 % en PBS durante 30 min, las secciones se bloquearon en BSA al 5 %, Triton X-100 al 0,3 % en PBS y se tiñeron con un anticuerpo IgG Fc antihumano de cabra (dilución 1:500, Bethyl Laboratories) y un anticuerpo NeuN anti-ratón de ratón (dilución 1:500, Millipore), un anticuerpo anti-GFAP de ratón (dilución 1:500, GA5, Cell Signaling Technologies) o un anticuerpo anti-Iba1 de ratón (dilución 1:500, GT10312, GeneTex ) en BSA al 1 % y Triton X-100 al 0,1 % en PBS a 4 °C durante la noche. Se visualizaron anti-IgG Fc humana y anti-NeuN con un anticuerpo secundario anti-cabra conjugado con Alexa Fluor 488 o un anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con Alexa Fluor 594, respectivamente (dilución 1:200, Thermo Fisher). Las imágenes fluorescentes de las regiones corticales se obtuvieron con el Keyence BZ-X810. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Kanazawa y se realizó de acuerdo con las pautas y regulaciones.

Se utilizó Graphpad Prism 6.0d para la representación gráfica y el análisis estadístico. Los métodos estadísticos relevantes para experimentos individuales se detallan en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y su información complementaria. Los datos de RNA-seq están disponibles en el archivo de lectura de secuencias DDBJ con los números de acceso DRA014557 (esferoides de hepatocitos) y DRA014558 (hígados de ratones PXB). Los datos sin procesar generados durante el estudio están disponibles de los autores correspondientes a pedido razonable. Los datos fuente para las cifras se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue apoyado por: World Premier International Research Center Initiative (WPI), MEXT, Japón; una subvención de ayuda para investigación científica JSPS (C) (20K06553) a KS; una subvención de ayuda para investigación científica JSPS (B) (19H03499) e investigación desafiante (21K18250) para KM; Programa de Investigación Básica y Clínica sobre la Hepatitis de la Agencia Japonesa de Investigación y Desarrollo Médico (AMED) (JP21fk0210087) a KS; Proyecto de plataforma AMED para apoyar el descubrimiento de fármacos y la investigación en ciencias de la vida (Base para apoyar el descubrimiento de fármacos innovadores y la investigación en ciencias de la vida) para HS (JP19am0101090) y JT (JP19am0101075); y una subvención de ayuda para JSPS Scientific Research (B) (21H01771) a MS el Instituto de Investigación del Cáncer (Universidad de Kanazawa). Agradecemos a Dolphin Co. Ltd por la revisión en inglés.

División de Dinámica y Regulación Tumoral, Instituto de Investigación del Cáncer, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Katsuya Sakai, Nichole Marcela Rojas-Chaverra, Hiroki Sato, Ryu Imamura, Itsuki Sakai & Kunio Matsumoto

Instituto de Ciencias de la Vida WPI-Nano (WPI-NanoLSI), Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Katsuya Sakai, Ryu Imamura, Mikihiro Shibata y Kunio Matsumoto

Laboratorio de Síntesis y Expresión de Proteínas, Instituto de Investigación de Proteínas, Universidad de Osaka, Suita, Japón

Nozomi Sugano-Nakamura, Emiko Mihara, Sayako Watanabe y Junichi Takagi

Unidad de Investigación del Microambiente Tumoral, Instituto para la Iniciativa Científica Fronteriza, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Hiroki Sato y Kunio Matsumoto

Unidad de Inflamación y Plasticidad Epitelial, Instituto de Investigación del Cáncer, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Dominic Chih Cheng Voon

Unidad Innovadora de Investigación de Modelos de Cáncer, Instituto para la Iniciativa Científica Fronteriza, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Dominic Chih Cheng Voon

Departamento de Investigación y Desarrollo, PhoenixBio Co. Ltd, Higashihiroshima, Japón

Chihiro Yamasaki y Chise Tateno

AFM de alta velocidad para la Unidad de Aplicación Biológica, Instituto para la Iniciativa Científica Fronteriza, Universidad de Kanazawa, Kanazawa, Japón

Mikihiro Shibata

Departamento de Química, Escuela de Graduados en Ciencias, Universidad de Tokio, Tokio, Japón

hiroaki suga

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KS, H. Suga, JT y KM concibieron y diseñaron el estudio. KS realizó la expresión y purificación de proteínas, ensayos celulares, SPR para FcRn, crosslink, RNA-seq, experimentos de vida media en suero y ensayo de unión de mTfR. NS-N. realizó citometría de flujo y SPR para Met. EM realizó una evaluación preliminar de los injertos Fc y sus actividades. SW realizó la expresión y purificación de proteínas, y el mapeo del sitio de unión a través de los experimentos Met quiméricos. RMN-C. realizó experimentos de penetración BBB. IS realizó ds-variantes. H. Sato realizó inmunohistoquímica y contribuyó a experimentos con animales. RI contribuyó a los experimentos con animales. DC-CV contribuyó a los experimentos con animales y revisó críticamente el manuscrito. CY y CT realizaron el marcaje de BrdU en ratones PXB. MS realizó HS-AFM. El manuscrito fue escrito por KS Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Katsuya Sakai, Junichi Takagi o Kunio Matsumoto.

H. Suga y JT son cofundadores y accionistas de MiraBiologics Inc. EM, KS y KM también son accionistas de la misma empresa. Los demás autores declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Biomedical Engineering agradece a Richard Siegel, Birgit Schoeberl, Manuel Sanchez-Felix y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

El medio acondicionado del cultivo en suspensión Expi293F que expresaba el control Fc o las variantes de Fc se redujo utilizando perlas de proteína A y se analizó mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras y se tiñó con azul brillante de Coomassie. La imagen de Fc(aMD4) se reprodujo de nuestro informe anterior27.

Sensorgramas de unión de Fc o Fc (aMD4) a MetECD humano según lo determinado por resonancia de plasmones superficiales. Las curvas medidas se muestran en rojo. Las curvas ajustadas se muestran en negro. RU, unidades de resonancia; SPR, resonancia de plasmones superficiales.

a, Niveles de fosforilación de residuos de met tirosina en células EHMES-1 tratadas con HGF o Fc(aMD4)B3 durante 10 min. Los lisados ​​se analizaron mediante transferencia Western. bc, las células EHMES-1 se trataron con HGF (b) o Fc (aMD4) B3 (c). La activación de Met, Akt o Erk1/2 en cada punto de tiempo después de la estimulación se cuantificó in situ con Met antifosforilado (Tyr1234/1235), Akt antifosforilado (S473) o Erk1/2 antifosforilado (T202/Y204 ) anticuerpo, respectivamente. Los resultados se muestran como la media ± SEM de la inducción de veces en relación con los controles no estimulados (n = 4, experimentos independientes).

Datos fuente

a, La asociación entre Fc(aMD4)B3 y MetECD humana, MetECD de ratón o MetECD quimérica que fusionaba de forma variable humanos y ratones se evaluó mediante un ensayo desplegable. MetECD marcado con PA se precipitó utilizando perlas conjugadas con anticuerpo anti-marca de PA. De acuerdo con nuestro informe anterior de que el péptido aMD4 se une a MetECD40 humano pero no de ratón, Fc (aMD4) B3 se une a MetECD humano (hWT) pero no a MetECD de ratón (mWT). El reemplazo del dominio PSI y los dominios IPT por secuencia de ratón (variantes A–E) conservó la unión a Fc(aMD4)B3, lo que indica que el dominio PSI y los dominios IPT eran prescindibles para la unión de Fc(aMD4)B3. Por el contrario, se requirieron residuos específicos humanos en las hojas 5–7 del dominio Sema para la unión de Fc (aMD4) B3 (variante F). Los números en el dominio Sema indican cada hoja. b, los residuos específicos de humanos en la lámina 6 (B6-1 y B6-2 en d) eran indispensables para la unión de Fc(aMD4)B3. c, los residuos específicos de humanos en la cuchilla 5 (B5-1 y B5-2 en d) también fueron indispensables o contribuyeron a la unión de Fc (aMD4) B3, respectivamente. d, alineación de la secuencia de aminoácidos de los dominios Met Sema humano y de ratón. Los residuos que son diferentes entre humanos y ratones se indican en negrita. Las barras rojas (B5-1, B6-1 y B6-2) indican los residuos indispensables para la unión de Fc(aMD4)B3. La barra naranja (B5-2) indica los residuos que contribuyen a la unión de Fc(aMD4)B3.

a, El peso molecular analizado por SDS-PAGE indicó un complejo 2:1 y 1:1 de MetECD y Fc(aMD4)B3. El análisis SDS-PAGE se realizó utilizando geles al 7,5% (azul, de la Fig. 3b) y geles al 3-10% (naranja, de b). b, análisis SDS-PAGE de la formación de dímero Met por Fc(aMD4) in vitro. Los complejos entre MetECD y Fc(aMD4) o Fc de control se entrecruzaron con BS3 y se analizaron con SDS-PAGE (gel al 3-10 %) en condiciones no reductoras y se tiñeron con plata. c, MetECD y Fc(aMD4)B3 se entrecruzaron con BS3 y se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se muestran los resultados de SDS-PAGE no reductora de las fracciones SEC con tinción azul brillante de Coomassie. La fracción indicada en rojo se sometió a HS-AFM como se muestra en la Fig. 3e, f.

Datos fuente

a, Sensorgramas de unión de Fc a FcRn/β2 M a pH 6,0 y 7,4. Culo, adición de Fc; Diss, lavado tampón. b, Sensorgramas de unión de Fc o Fc(aMD4) a FcRn/β2 M a pH 6,0. Los sensogramas muestran duplicados de tres concentraciones de analitos (250, 500, 1000 nM). RU, unidades de resonancia; SPR, resonancia de plasmones superficiales.

Cifras complementarias.

Análisis HS-AFM de Fc(aMD4)B3.

Análisis HS-AFM de MetECD.

Análisis HS-AFM de un complejo 2:1 de MetECD y Fc(aMD4)B3 con los dominios del tallo IPT rociados.

Análisis HS-AFM de un complejo 2:1 de MetECD y Fc(aMD4)B3 con los dominios de tallo IPT adjuntos.

Datos de origen para la figura complementaria 3.

Datos de origen para la figura complementaria 6.

Datos fuente.

Datos fuente.

Datos fuente.

Datos fuente.

Datos fuente.

Datos fuente.

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Reimpresiones y permisos

Sakai, K., Sugano-Nakamura, N., Mihara, E. et al. Diseño de agonistas de receptores con farmacocinética mejorada mediante el injerto de péptidos macrocíclicos en regiones cristalizables de fragmentos. Nat. biomedicina Eng 7, 164–176 (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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Recibido: 22 de octubre de 2021

Aceptado: 26 de septiembre de 2022

Publicado: 07 noviembre 2022

Fecha de emisión: febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-022-00955-6

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Naturaleza Ingeniería Biomédica (2022)