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Jan 02, 2024

Modificación y preparación eficientes de ADN circular para expresión en cultivo celular

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 5, Número de artículo: 1393 (2022) Citar este artículo

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Los plásmidos de ADN son una herramienta esencial para la entrega y expresión de ARN y proteínas en experimentos de cultivo celular. La preparación de plásmidos normalmente implica un laborioso proceso de clonación, validación y purificación bacteriana. Si bien los plásmidos de expresión se pueden diseñar y pedir a los fabricantes contratados, el costo puede ser prohibitivo cuando se requiere una gran cantidad de plásmidos. Hemos desarrollado un método y protocolo totalmente sintético eficiente que permite la producción de ADN circular que contiene elementos de expresión listos para la transfección en tan solo 3 horas, eliminando así los pasos de clonación bacteriana. El protocolo describe cómo tomar un fragmento de ADN lineal de doble cadena y circularizar y purificar de manera eficiente este fragmento de ADN con un tiempo mínimo de manipulación. Como prueba del principio, aplicamos el vector circular que expresa ARN guía de edición principal diseñado (epegRNA) en cultivo celular, y demostramos un rendimiento coincidente e incluso superior de este método en comparación con las guías expresadas por plásmidos. La velocidad de preparación, el bajo costo y la facilidad de uso del método lo convertirán en una herramienta útil en aplicaciones que requieran la expresión de ARN cortos y proteínas.

Existen muchas técnicas para la preparación y entrega de ARN y proteínas para la expresión transitoria en cultivos celulares1. En este estudio, presentamos un método de preparación nuevo y eficiente. Como demostración, describiremos el uso de nuestro método en el contexto de la aplicación de edición de genes. Sin embargo, dado que el principio detrás de este método es genérico, este método puede ser útil para una variedad de propósitos y aplicaciones que requieren la expresión de ARN y proteínas. Aunque discutiremos la implementación específica para la edición de genes y compararemos nuestro método con algunas técnicas de preparación existentes, el objetivo de este documento es presentar un nuevo enfoque para preparar los vectores de expresión en un entorno de laboratorio, y no un método de edición de genes más eficiente como semejante.

Los tres enfoques más habituales que facilitan la edición de genes cuando se introducen en las células son: (I) plásmidos únicos o múltiples2 que codifican Cas9 y otras proteínas complementarias e implementaciones de ARN guía adecuados para CRISPR/Cas9 tradicional, edición básica, edición principal u otros métodos3,4 ,5,6; (II) ARNm de Cas9 y ARN guía 7; (III) Proteína Cas9 complejada con ARN guía8. Actualmente se están utilizando una variedad de métodos de administración de las construcciones de edición de genes antes mencionadas. La elección del método de entrega dependerá de los requisitos específicos y las preferencias del investigador, que pueden incluir electroporación9,10, lipofección11, transfección física directa12, entrega de vectores en partículas poliméricas y microportadores13, y modalidades de los métodos antes mencionados.

El enfoque (I), la edición de genes mediante la transfección de plásmidos para la expresión transitoria se usa comúnmente debido a su simplicidad conceptual, facilidad de manejo y estabilidad de los plásmidos. Sin embargo, la preparación de plásmidos es un proceso intensivo en mano de obra y lento que normalmente toma 2 días2 (consulte los pasos típicos de clonación bacteriana en la Nota complementaria 1).

Hemos desarrollado un método y protocolo totalmente sintético eficiente que permite la producción de ADN circular que contiene elementos de expresión listos para la transfección en tan solo 3 h, eliminando así los pasos de clonación bacteriana. El ADN circularizado es resistente a la degradación por exonucleasas en el citoplasma14. El ADN lineal carece de tal estabilidad, lo que es una barrera importante para utilizarlo para la entrega de genes. Además, nuestro método aprovecha esta diferencia en las propiedades mediante el uso de exonucleasa para digerir fragmentos de ADN lineal que no reaccionaron o que reaccionaron incorrectamente, purificando así el ADN circular.

Determinamos que el rango práctico de la longitud del vector de expresión está entre 450 y 950 pb, donde alcanza hasta un 62 % de eficiencia para convertir el ADN bicatenario lineal de entrada (dsDNA) en vectores de expresión circulares; el método también podría usarse con menor eficiencia para fragmentos algo más largos. Por brevedad, consistencia y para evitar confusiones con la descripción de los pasos de preparación y el producto final en este documento, nos referiremos a esta construcción y método de vector de expresión de ADN circular como un vector circular, en mayúsculas y en cursiva.

Para demostrar que tales construcciones de ADN circular pueden funcionar como vectores de expresión, aplicamos este método para crear ADN circular para expresar el ARN guía de edición principal diseñado (epegRNA)5,15,16, y editamos con éxito tres ubicaciones genómicas que fueron exhibidas por Chen et al.15, lo que resultó en una eficiencia de edición comparable.

El objetivo de esta investigación fue desarrollar y validar un método eficaz de preparación de un solo tubo para la administración y expresión de ARN y proteínas en experimentos de cultivo celular. La circularización de las principales guías de edición se realizó siguiendo el protocolo descrito en la sección Métodos y representado esquemáticamente en la figura 1.

un elemento de expresión que contiene sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS con salientes complementarios en ambos extremos del fragmento de ADN. b Los cortes por la enzima de restricción y la ligadura de los salientes resultantes forman el elemento de expresión de ADN circular. La exonucleasa T5 se usa para digerir todo el ADN no circularizado. c Vista esquemática de los voladizos complementarios de 4 nt (gtac) creados por cortes de enzimas de restricción (BsaI GGTCTC), consulte la Fig. 1 complementaria para ver un ejemplo detallado de la edición principal de la codificación de epegRNA. Reactivos de enzimas de restricción IIS, luego programe la incubación a 37 oC durante 1 h (o más, si lo desea), seguida de la activación por calor de la ligasa de ADN T4 a 65 oC durante 15 min. Si se deja desatendido, configure el ciclador de programas para que haga una pausa a 4 oC. e Agregue un volumen igual de reactivos de exonucleasa T5 al mismo tubo y digiera a 37 oC durante 1 hora. f Purifique el constructo de expresión de ADN circularizado de la mezcla de reacción con un kit de limpieza de ADN.

El rendimiento relativo de la reacción (ver Fig. 2a), se define en la ecuación. (1) por la relación entre la cantidad de ADN circularizado después de la purificación y el rendimiento máximo teórico posible al excluir los sitios de enzimas de restricción y el relleno de extremos de ADN o los adaptadores de PCR (consulte la Fig. 1 complementaria y una descripción más detallada en la sección Métodos). La longitud típica del constructo de expresión de epegRNA PEmax circularizado estaría entre 450 y 500 pb, incluido el promotor y la secuencia que codifica para pegDNA con el bucle de ARN final, como se describe en Chen et al.15. Para esta investigación, elegimos un vector circular de 452 pb que codifica para una sustitución de un solo nucleótido en el gen HBB15. Diseñamos un conjunto de dsDNA con diferentes longitudes de relleno compuestas de secuencias de dsDNA aleatorias para probar cómo el rendimiento depende de la longitud del dsDNA de entrada y la duración del paso de circularización (ligación). Agregar dicho relleno de ADN de 100, 300, 500, 880 y 1330 pb a un vector circular básico de 452 pb dio como resultado vectores circulares de 552, 752, 952, 1332 y 1782 pb (consulte la Fig. 1 complementaria). Además, probamos una estructura circularizada acortada de 282 pb que era demasiado corta para contener un vector de expresión funcional en nuestra implementación pero que era interesante desde la perspectiva de verificar el comportamiento de construcciones potencialmente más cortas.

a Rendimiento relativo en un rango de longitudes de ADN de entrada a 1, 2 y 12 h de circularización. Los nodos de línea representan los promedios de n = 2–3 muestras de reacción independientes; los puntos muestran muestras de datos individuales para los nodos, desplazados horizontalmente para mayor visibilidad. b Imagen de combinación de electroforesis en gel. En cada subparcela, Carril 1 = 1 h, Carril 2 = 2 h y Carril 3 = 12 h de circularización. La cantidad de ADN se normalizó a 300 ng por carril en subparcelas de 282 a 952 pb. Para evitar la sobrecarga debido al pequeño número de bandas, la cantidad de ADN se normalizó a 150 ng por carril para las subparcelas de 1332 y 1782 pb. Los carriles en cada subparcela son un subconjunto de carriles de una misma placa de gel para cada longitud de vector circular, recortados solo para reducir el número de carriles sin ninguna mejora de imagen; las fotografías completas del gel están disponibles en los Datos complementarios. c Diagrama esquemático de la autocircularización y la unión de múltiples fragmentos repetidos.

El rendimiento relativo del protocolo para las longitudes de vector circular probadas y las duraciones de circularización se presenta en la Fig. 2a. En particular, el rendimiento fue más alto para el rango de longitud de ADN circular que coincide con las longitudes de nuestros vectores de edición principal (en o por encima de 450 pb). Excluyendo este pico de alto rendimiento, el rendimiento se mantuvo relativamente constante y disminuyó rápidamente para longitudes superiores a 1000 pb.

Los resultados de la electroforesis en gel muestran una imagen que contiene exclusivamente ADN circularizado en múltiples bandas (ver Fig. 2b). Como era de esperar, además de la circularización de una sola unidad, algunas ligaduras dieron como resultado concatámeros duplicados, triplicados y de orden superior, que se representan esquemáticamente en la Fig. 2c. Esta hipótesis se confirmó cortando, purificando y secuenciando las bandas individuales, así como volviendo a ejecutar la electroforesis en gel en el ADN purificado de las bandas individuales. En todos los casos, la secuenciación de Sanger confirmó la combinación perfecta entre los diseños y los vectores circulares construidos. La mayor parte de la circularización ocurrió dentro de la primera hora, excediendo el 48% en un tamaño de 452 pb y disminuyendo al 26% en 952 pb, lo que lo convierte en un método prácticamente útil en todo este rango de longitud. Como era de esperar, mientras que el rendimiento aumentó aún más con una mayor duración de la circularización/ligadura, la proporción de combinaciones de orden superior también aumentó con la duración de la ligadura (ver imágenes de gel en la Fig. 2b).

El análisis de las imágenes de electroforesis en gel utilizando el software ImageJ17 de los Institutos Nacionales de la Salud mostró que la representación de la banda más alta por el peso del ADN aumentó ligeramente con la duración de la circularización (ver Fig. 3a). Esto es particularmente notable cuando se compara la Banda 1 (ADN circular único, línea azul) con el valor acumulativo de las Bandas 3 y superiores (línea amarilla). Solo con un tamaño de vector circular de 282 pb, la banda 1 símplex representa menos que la banda 2 y menos que el valor combinado de las bandas 3 y superiores de las unidades de vector por peso en la salida de la reacción.

Mostramos la primera, la segunda y la suma de las bandas tercera y superior correspondientes a los concatemeros simples, dobles y la suma de los de orden superior. Los nodos de línea representan los promedios de n = 2 muestras de reacción independientes calculadas a partir del brillo de la banda de electroforesis en gel; los puntos muestran muestras de datos individuales para los nodos, desplazados horizontalmente para mayor visibilidad. a El peso relativo del ADN es igual al brillo relativo de la banda. b El recuento molar relativo de la banda se cuenta como el brillo relativo de la banda dividido por el número de banda (consulte también la ecuación (2)).

El número de unidades molares siempre es relativamente alto para la Banda 1, ya que la representación molar es proporcional al peso del ADN de la banda dividido por el número de bandas (ver Fig. 3b). Para una duración de ligadura de 1 h en un vector circular de entre 450 y 950 pb de longitud, la banda 1 forma una fracción molar de ~70 %, la banda 2 representa otro 20 % y las bandas de orden superior combinadas representan las 10–15 restantes % A las 12 h de la ligadura, la participación de la banda 1 se desplaza a la baja en un ~6 %, mientras que la banda 2 permanece bastante constante, y la participación de las bandas superiores combinadas aumentó en un ~6 %. Esto representa un aumento en el peso de las bandas de orden superior con un rendimiento adicional mínimo, si es que lo hay, para los vectores circulares de una sola unidad.

A la inversa, por encima de 1000 pb, las bandas superiores se combinan por debajo del 5% de fracción molar. Sin embargo, debido a su bajo rendimiento del 5% al ​​8%, consideramos que estos vectores circulares más largos no son útiles en la práctica en nuestro método. Nuestra hipótesis es que estos cambios en la longitud del ADN de entrada para el rendimiento y la distribución de fracciones de concatémeros de vectores circulares unidos, incluido el aumento aparente en el rendimiento de alrededor de 450 pb, probablemente se deban a una combinación de longitud de ADN y patrones de plegamiento afectados por el pH de la mezcla de reacción, influencias iónicas y la temperatura de reacción18.

Si bien la mayoría de los vectores circulares por número se componen de unidades simples y dobles, los concatémeros de orden superior se representan de manera desproporcionada en peso. Para la transfección, es importante poder calcular una proporción molar del plásmido portador de Cas9 y el plásmido guía. La eficiencia de transfección de plásmidos es siempre <100 % de las células y varía según el tipo de célula, el tamaño de los plásmidos y los métodos de transfección. Determinar la proporción perfecta cuando se cotransfectan dos plásmidos es laborioso19, y cuando dos plásmidos cotransfectados difieren en tamaño, se suele utilizar un exceso molar del plásmido más pequeño, véase, por ejemplo, Bosch et al.20. En nuestros experimentos de validación de edición principal, los vectores circulares son cinco veces más pequeños que los plásmidos que expresan epegRNA16 que sustituyen, mientras que estos plásmidos16 de epegRNA son aproximadamente cinco veces más pequeños que los plásmidos coincidentes que expresan Cas915 (ver discusión adicional). Por lo tanto, calculamos un "multiplicador molar" que indica cuánto más Vector circular por peso debe usarse en comparación con el caso de un Vector circular puro de una sola unidad usando la Ecuación (2). Los valores del multiplicador molar para 1 h y 12 h de ligadura en la Fig. 4a implican que una ligadura de mayor duración da como resultado un aumento de la relación molar debido a un aumento predominante en la fracción de banda superior.

un multiplicador molar por longitud y duración de la circularización. Entre 452 pb y 952 pb, una regla práctica simple basada en la distribución es un multiplicador de 1,5x después de 1 h de circularización y de 1,7x durante 2 h de circularización o más. Por ejemplo, si el plásmido Cas9 tiene una longitud de 13 000 pb y el vector circular único tiene una longitud de 452 pb, entonces 1,0 μg del plásmido principal en una proporción molar de 1:1 requerirá 1,0 × 452/13 000 = 0,035 μg = 35 ng. Multiplicar por 1,5 dará como resultado 52 ng de un vector en lugar de 35 ng para una proporción molar de 1:1 basada en una reacción de circularización de 1 h. Los nodos de línea representan los promedios de n = 2 muestras de reacción independientes calculadas a partir del brillo de la banda de electroforesis en gel; los puntos muestran muestras de datos individuales para los nodos, desplazados horizontalmente para mayor visibilidad. b Validación del Vector Circular por primera edición HBB, CDKL5 y PRPN.

La validación de la funcionalidad del vector circular se realizó mediante la edición principal de las sustituciones de una sola base en el cultivo de células HEK293T en tres ubicaciones genómicas (es decir, HBB, PRPN y CDKL5) que Chen et al.15 utilizaron como demostración de la eficiencia mejorada de su método PEmax. Codificamos el diseño de la guía a partir de un estudio de Nelson et al.16, junto con el plásmido Addgene #17482815,21, que se modificó con la adición del gen de resistencia a la blasticidina para facilitar la selección de antibióticos. Usamos electroforesis en gel para purificar la primera banda de los vectores circulares HBB, PRPN y CDKL5 preparados, obteniendo así el vector circular de módulo de expresión único. También preparamos un conjunto de las mismas tres unidades de expresión con 500 pb agregados de relleno de ADN inactivo antes del promotor U6, como se describe anteriormente y se muestra en la Fig. 1 complementaria. Los detalles de la edición de genes se indican en la sección Métodos Transfección, manipulación y Secuenciación de células HEK293T editadas. Verificamos que el uso de una relación molar 8X del vector circular a los plásmidos Cas9 produjo una diferencia insignificante en la eficiencia de edición en comparación con la relación 4X y, por lo tanto, realizamos todos los experimentos de edición del genoma informados aquí con el exceso molar 4X habitual.

El análisis de eficiencia de edición realizado con EditR22,23 se resume en la Tabla 1 y se ilustra en la Fig. 4b. Es evidente que los vectores circulares son funcionales para la expresión de epegRNA cuando se usan como un componente de la edición principal, usando un exceso molar 4X de vectores circulares para el plásmido PE4max Cas9. La eficiencia de edición estuvo cerca de los resultados de PE4max informados por Chen et al.15 para dos de las tres ubicaciones editadas, y superó significativamente la eficiencia de edición de Chen et al.15 para la tercera ubicación: el locus PRNP, validando así el uso funcional de Vectores circulares. En particular, el uso de los vectores circulares preparados por nuestro protocolo resultó en una mejor eficiencia de edición que el vector circular de banda única purificado, validando así la ventaja de usar la mezcla que contiene una fracción de concatámeros, en lugar de las unidades circulares individuales. Los vectores circulares con relleno adicional de 500 pb mostraron una mayor eficiencia de edición entre un 1% y un 4% (marcados en negrita en la Tabla 1).

Formulamos la hipótesis de dos mecanismos que conducen a los resultados observados en la Tabla 1: (A) Quizás, las unidades circulares muy cortas de 452 pb interactúan con la polimerasa III de manera un poco menos eficiente que las estructuras circulares más largas24, y duplicar la longitud puede hacer que la interacción sea un poco más eficiente, lo que puede explicar el pequeño aumento observado en la eficiencia entre las columnas CV y ​​CV+500 pad, que contenían los 500 pb adicionales de relleno de ADN inactivo. Cuando se requiere la máxima eficiencia de edición, el relleno de ADN adicional se puede incorporar fácilmente en el diseño del vector circular, como en la Fig. 1 complementaria. (B) El mayor aumento en la eficiencia de edición entre las columnas Band 1 CV y ​​CV puede explicarse por ~ número 1,5 veces mayor de unidades de expresión por unidad molar de la mezcla de concatémeros de vectores circulares en relación con las unidades de expresión circulares individuales; además, los vectores circulares concatenados son automáticamente más largos. Esto también implica que la duración extendida de la circularización, lo que da como resultado una mayor representación de vectores circulares concatenados, también puede mejorar ligeramente la eficiencia de edición en un exceso molar fijo.

En resumen, los resultados anteriores demostraron que los vectores circulares de 450–950 pb preparados con nuestro protocolo son adecuados para la entrega y expresión de ARN para su uso como vectores de expresión de epegRNA en la edición principal en cultivos celulares.

El método y el protocolo de circularización presentados aquí describen cómo preparar vectores circulares que se pueden usar como un reemplazo eficiente para los plásmidos guía en la edición de genes CRISPR, básicos y principales en cultivos celulares. La principal ventaja de este método es que después de diseñar, pedir y recibir dsDNA de un proveedor comercial, el producto listo para la transcripción se puede preparar para su uso dentro de las 3 h, con poco tiempo de manipulación. Además, la mayor parte del tiempo práctico consiste en la limpieza básica de ADN del kit de columna de centrifugado. Si la cantidad de ADN recibida es baja y se requiere una amplificación por PCR, el proceso podría demorar una hora adicional para amplificar la cantidad necesaria de ADN de entrada.

Hay dos limitaciones o preocupaciones principales que deseamos discutir:

La cantidad de vector circular producido por una reacción sintética. Por lo general, una sola reacción de 50 μl producirá de 2,0 a 2,5 μg de producto. Aunque la reacción se puede ampliar con más reactivos, en situaciones en las que se necesita una gran cantidad de vectores, la capacidad de la clonación bacteriana para producir miligramos de producto en una preparación máxima hará que sea una mejor opción. En la mayoría de las situaciones, solo se realizan unas pocas ediciones con cada guía, por lo que la simplicidad y la velocidad de preparación favorecen nuestro método de circularización.

Nos gustaría discutir la tasa de error inherente al proceso de fabricación de fragmentos de ADN. La alta fidelidad es un conjunto sólido del método de clonación bacteriana. La tasa de error de replicación del ADN de E. coli a medida que clona un plásmido se estima en 5 ⋅ 10−10 por par de bases25. Una vez que se identifica mediante secuenciación y clonación una colonia de E. coli que contiene un plásmido perfecto, las posibilidades de que cualquier plásmido contenga un error son mínimas, siempre que se tomen precauciones26.

Por otro lado, la tasa de error anunciada por los fabricantes comerciales de fragmentos de ADN es bastante alta. Las tasas de error de fragmentos de ADN de menos de 800 pb de longitud producidos por tres fabricantes son: Twist Bioscience 1/6253 pb, Thermo Fisher Scientific 1/6757 pb e Integrated DNA Technologies 1/6757 pb. En particular, tanto Twist Bioscience27 como Thermo Fisher Scientific28 afirman que la verdadera tasa de error de los gBlocks de Integrated DNA Technologies es mucho mayor (1/2705 y 1/1329 respectivamente).

Consideremos el ejemplo del proceso de fabricación de Twist Bioscience, con una tasa de error de 1/6253 pb, y nuestro vector circular de 452 pb con un espaciador de orientación largo de 20 pb. Por lo tanto, la posibilidad de que ocurra un error en el espaciador es de aproximadamente 20 ÷ 6, 253 ≈ 1/312 para vectores circulares. Lo más probable es que no encuentren ningún objetivo en el genoma y podrían conducir a intentos de edición fuera del objetivo en una proporción muy pequeña de esta fracción ya pequeña de 1/312 de guías potencialmente no coincidentes. Chavez et al.29 respaldan esta conclusión y demostraron que las ediciones pueden ser tolerantes a múltiples desajustes entre el gRNA y el locus unido de manera inapropiada. Suponiendo que se produzca un error dentro del área del promotor de 264 pb (consulte la Fig. 1 complementaria), lo dejará funcional o lo dejará no funcional. Si el promotor no es funcional, no tendría ningún efecto sobre la precisión de la edición. Del mismo modo, si el error se encuentra en el área de andamiaje del ARN, lo más probable es que el enlazador, la extensión o el bucle final hagan que el epegRNA no funcione, sin afectar la precisión de la edición. Además, los vectores circulares normalmente se suministran en exceso del plásmido Cas9, y los vectores circulares no funcionales estarán respaldados por los funcionales.

Por lo tanto, se espera que la tasa de error adicional introducida por los vectores circulares sea de órdenes de magnitud menor que la producida por la edición principal en sí misma y, en mayor medida, CRISPR/Cas9 y la edición base3,4,5,15,30, porque todos de estos métodos exhiben inherentemente un nivel de 4 a 15 % de errores de edición y fuera del objetivo. El análisis de trazas de Sanger realizado con EditR para nuestras tres ubicaciones genómicas editadas no indicó ediciones no deseadas notables, lo que es consistente con el razonamiento mencionado anteriormente de que las ediciones no deseadas con el uso del método de vectores circulares, si las hay, serán órdenes de magnitud menos frecuentes que las ediciones exitosas.

En algunos casos, cuando es necesario expresar múltiples ARN, se puede implementar una solución con guías policistrónicas31. Los promotores U6 expresan ARN sin secuencias de localización nuclear adicionales presentes en un plásmido16,32,33, y nuestros experimentos de validación confirmaron esto para vectores circulares. Al implementar otros promotores, el diseño, de manera similar a los plásmidos, puede necesitar asegurar la localización nuclear34,35.

Hay ciertas situaciones en las que se deben expresar dos o más ARN que requieren promotores separados, o están presentes múltiples repeticiones en el diseño de dsDNA deseado. Por ejemplo, los métodos de edición principal PE3 o PE5max15 requieren una segunda guía de ARN para producir una muesca adicional. Existen escenarios aún más complejos6,36. En tales casos, se pueden combinar varios elementos dentro de un vector circular. La mayoría de los fabricantes no pueden producir fragmentos de ADN con repeticiones largas (p. ej., promotores repetitivos o armazones pegRNA). Sin embargo, el dsDNA se puede ordenar como fragmentos separados y realizar el sencillo paso adicional de la ligadura lineal puede preparar un dsDNA lineal combinado que se puede circularizar posteriormente mediante el método del vector circular (consulte la Fig. 2 complementaria y la Nota complementaria 3: Unión lineal de fragmentos de dsDNA ). Por ejemplo, la edición principal de PE3 y PE515 requiere dos promotores U6 que permitan la transcripción de dos guías de ARN. Las construcciones correspondientes se insertan habitualmente en un solo vector de plásmido mediante el ensamblaje Golden Gate o Gibson, seguido de la clonación bacteriana. En un escenario aún más complejo, muchas etapas de ensamblaje y clonación bacteriana implican ~1 semana de trabajo y manipulación36. En principio, el paso de unión requiere diseñar y ordenar fragmentos que se puedan cortar con una enzima de restricción de tipo IIS intermedia (es decir, BbsI en el ejemplo presentado en la Fig. 2 complementaria). La unión se puede lograr en un par de horas, con una reacción de Paso 1 de 1 h descrita en Métodos, seguida de limpieza de ADN para descartar cortes de extremos de ADN cortos. Según nuestra experiencia, dicha ligadura lineal permite unir dsDNA lineal con una eficiencia de casi el 100 %, y las pérdidas se deben principalmente a la limpieza con un kit de columna giratoria. A este paso preliminar puede seguirle la circularización mediante el protocolo Circular Vector, lo que da como resultado que todo el proceso se complete muchas veces más rápido que las muchas etapas de la clonación bacteriana. Además, en circunstancias en las que se requiere un vector circular puro de una sola unidad, se puede extraer mediante electroforesis en gel.

Otra ventaja importante de este método es su bajo costo. Nuestro ejemplo de cálculo de costos en la sección Reactivos, materiales y costos muestra que el costo fijo del fragmento de dsDNA lineal solicitado a un proveedor comercial es de $32,90 por un vector circular de 452 pb. La reacción cuesta sólo $9.30. Si se requiere amplificación por PCR, esto agrega $ 4.76 al total y elimina la necesidad de volver a pedir los fragmentos de dsDNA de entrada a un proveedor. El protocolo produce de 2,0 a 2,5 μg de vector circular, que es suficiente para más de 10 ediciones en una placa de 24 pocillos (según las cantidades que usamos en la sección Protocolo paso a paso) y ~40 ediciones en una placa de 96 pocillos lámina. Esto se compara favorablemente con la clonación bacteriana, donde el costo total desde el diseño hasta un plásmido listo para la transfección suele ser varias veces mayor (además de un tiempo total y práctico mucho más largo). Es incluso más caro pedir plásmidos listos para usar, como se presenta en la Nota complementaria 5 sobre el ejemplo de precios de dos fabricantes por contrato, y aún más caro pedir epegRNA prefabricado.

En esta investigación, presentamos un método y protocolo de circularización para la preparación de vectores circulares que se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones que requieren la expresión de proteínas y ARN cortos. Para una longitud de vector circular de 450 pb, la eficiencia de convertir el ADN de entrada en vectores circulares fue del 48 % a 1 h de ligadura y hasta del 62 % a las 12 h de ligadura. Para una longitud de 950 pb, esta eficiencia fue del 26 % a 1 h de ligadura y del 30 % a las 12 h de ligadura, con valores intermedios para vectores circulares entre 450 y 950 pb de longitud. Los tiempos de reacción más largos se correspondían con alguna mejora en el rendimiento del vector circular. Sin embargo, un paso de ligadura corto de 1 h tiene la ventaja de un procesamiento rápido y eficiente de 3 h de principio a fin.

Como prueba del principio, aplicamos el vector circular que expresa epegRNA en cultivo celular y demostramos que este método coincide y supera el rendimiento en comparación con la entrega de plásmidos informada por Chen et al.15. Su velocidad, bajo costo y facilidad de uso harán de este método otra herramienta valiosa en el conjunto de herramientas de edición de genes, mientras que la simplicidad de la reacción hace que el protocolo sea adecuado para sistemas automatizados de manejo de líquidos37.

Con este método, que consiste en una reacción de dos pasos de un solo tubo seguida de una limpieza de ADN típica basada en una columna giratoria, un investigador puede producir un lote de vectores circulares en 3 h. El método del vector circular simplifica la creación de pequeños componentes de orientación variable que funcionan junto con un plásmido grande e invariable que codifica Cas9 y/u otras proteínas y genes. Este gran plásmido se puede clonar en grandes cantidades en cultivo bacteriano, se puede extraer con uno de los maxi-preps disponibles en el mercado y se puede usar para meses o incluso años posteriores de experimentos. En particular, el componente variable para cada objetivo de edición, el vector circular, ahora es muy fácil de hacer.

El ADN circularizado es resistente a la degradación por exonucleasas en el citoplasma14. El ADN lineal carece de tal estabilidad, lo que es una barrera importante para utilizarlo para la entrega de genes. Además, nuestro método aprovecha esta diferencia en las propiedades mediante el uso de exonucleasa T5 para digerir fragmentos de ADN lineal que no reaccionaron o que reaccionaron incorrectamente, purificando así el ADN del vector circular.

Nuestro método de circularización para los vectores de expresión de la guía CRISPR requiere un diseño de secuencia de ADN inicial, que se puede crear con las herramientas preferidas del investigador (usamos SnapGene 6.0.7), seguido de un pedido de fragmentos de dsDNA de un fabricante comercial.

El dsDNA prefabricado debe, como mínimo, contener un promotor (U6, en nuestro ejemplo), seguido de un segmento de ADN que codifica epegRNA con un terminador38 (consulte la Fig. 1a y el mapa detallado en la Fig. 1 complementaria). El epegRNA se puede diseñar utilizando una herramienta publicada adecuada para este propósito15,16,39. Dos sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de tipo IIS coincidentes crean salientes complementarios de 4 nt cerca de ambos extremos del fragmento de dsDNA. El vector circular se puede validar convenientemente con la secuenciación de Sanger (ver Fig. 1b). La colocación de dos cebadores, Sanger-1 y Sanger-2, cerca de las ubicaciones opuestas de la estructura circular ha demostrado ser eficiente y confiable, cubriendo la mayor parte de la estructura circular con la superposición que incluye el cebador opuesto cerca de la mitad de la secuencia FASTA. Si se prefiere la secuenciación del plásmido completo, las empresas que realizan dicha secuenciación, por ejemplo, Plasmidsaurus (www.plasmidsaurus.com), requieren un círculo mínimo de 2000 pb; sin embargo, las técnicas basadas en la amplificación del círculo rodante, como la desarrollada por Octant40, pueden ser capaces de secuencia de dsDNA circular corta.

Los salientes coincidentes creados por los cortes de enzimas de restricción están diseñados para proporcionar una ligadura de alta fidelidad41, que también se ve favorecida por la ausencia de otros salientes que estarían presentes en un ensamblaje Golden Gate típico (ver Fig. 1c). Las secuencias 'nnnnnn' en la Fig. 1c representan el mínimo de seis pares de bases requeridos en el extremo posterior de la enzima de restricción. Algunos fabricantes (p. ej., Twist Bioscience) prefieren entregar sus fragmentos de ADN con adaptadores finales que sirven como cebadores de amplificación PCR bien diseñados y, al mismo tiempo, eliminan la necesidad de incorporar secuencias finales.

Nuestro objetivo era hacer que el método de producción de vectores circulares fuera fácil de usar y rápido. Por lo tanto, utilizamos principalmente enzimas de reacción y tampones basados ​​en kits comerciales, con solo unos pocos reactivos adicionales. Si se desea, los kits pueden sustituirse por reactivos individuales. Si se recibe una cantidad suficiente de dsDNA de un fabricante comercial, puede usarse directamente en la reacción; de lo contrario, puede ser necesario amplificarlo por PCR para obtener la cantidad deseada. El protocolo para la preparación de los vectores de ADN circularizado consta de tres pasos:

Paso 1: Circularización del ADN fuente (Fig. 1d). Mezcle los reactivos de reacción enumerados en la Tabla 2 pipeteando, preferiblemente en hielo, en un tubo de PCR de 200 μl u otro tubo adecuado con al menos el doble del volumen de reacción de la Tabla 2. El volumen adicional será necesario para la adición de los reactivos de digestión en el Paso 2. Coloque el tubo en un termociclador y ejecute la reacción como se describe en el programa del termociclador de la Tabla 2.

Paso 2: Digerir todo el ADN lineal restante (Fig. 1e). Prepare la mezcla de reacción de exonucleasa T5 como se indica en la Tabla 3 y mézclela en una proporción de 1:1 en el tubo que contiene la mezcla de reacción del paso anterior. Por ejemplo, si se realizó una reacción de 50 μl en el paso 1, será necesario agregar 50 μl. Programe y ejecute el termociclador como se indica en la tabla 3 del programa del termociclador.

Paso 3: Limpieza del ADN circularizado (Fig. 1f). Utilice un kit de columna giratoria como el QIAquick PCR Purification Kit o su método preferido.

Los pasos del protocolo anterior son suficientes para una aplicación práctica del método. Para una explicación detallada de los pasos y el razonamiento detrás de ellos, lea la siguiente sección.

La digestión con enzimas de restricción y la reacción de ligadura son seguidas por 15 min de inactivación por calor para finalizar la reacción de ligadura (ver Fig. 1D). La temperatura de reacción constante de 37 oC se eligió para minimizar la ligadura por desajuste42,43. La ligasa de ADN T4 se inactiva a 65 oC. Dado que la enzima de restricción se eligió con una temperatura de inactivación más alta, la enzima de restricción permanecerá activa y ayudará ligeramente en el siguiente paso de digestión. Se determinó experimentalmente que las concentraciones de ligasa y enzima de restricción funcionaban mejor con una concentración ligeramente superior a la habitual en el ensamblaje Golden Gate. Esta concentración más alta tiene dos propósitos: facilita el procesamiento rápido y, lo que es más importante, la enzima de restricción corta rápidamente para liberar los salientes en ambos extremos de un fragmento de ADN, lo que permite la autoligación de estos salientes en el mismo fragmento de ADN y limita la proporción de múltiples fragmentos de ADN que se ligan entre sí (ver discusión adicional en la sección Resultados). Las concentraciones de dsDNA lineal de entrada se probaron en un rango de 7,5 a 120 ng/μl y produjeron un rendimiento y una composición de ADN circularizado indistinguible. Una concentración de 120 ng/μl da como resultado la entrada de 6,0 μg de ADN por 50 μl de reacción, lo que se consideró óptimo desde el punto de vista de la manipulación y el costo del reactivo. La adición de ATP puede ser opcional para una duración de ligadura de 1 h, con concentraciones crecientes de ATP de 1 mM proporcionado por el tampón de ligasa de ADN T4 NEB a 2 mM que muestra una ligera mejora en el rendimiento, particularmente en duraciones de ligadura más largas. Esto puede deberse al agotamiento de ATP con una alta concentración de ADN ligado, así como a la inactivación de ATP en reacciones de mayor duración. La concentración de ATP de 2 mM está dentro del rango óptimo para las mezclas de ligasa de ADN T444, y el reactivo de ATP es económico. La sustitución de la enzima de restricción por una enzima de tipo IIS diferente puede ser necesaria en los casos en que la secuencia que codifica epegRNA incluye el sitio de reconocimiento de BsaI (para ver un ejemplo del uso de BbsI en un escenario ligeramente diferente, consulte la Fig. 2 complementaria).

Digestión de ADN no circularizado (Fig. 1e). Este paso consiste en agregar una cantidad igual de reactivos de exonucleasa de ADN T5 a la reacción de ligadura. Por ejemplo, se agregan 50 μl de mezcla de reacción de exonucleasa a 50 μl de salida de reacción de ligadura, lo que da como resultado un nivel cómodo de 100 μl de mezcla de reacción en un termociclador típico de tubo de PCR Eppendorf de 200 μl (pueden ser necesarios tubos más grandes y baños secos, etc.). se utiliza si se desea). La concentración de exonucleasa de ADN T5 se validó como suficiente para digerir completamente todo el ADN lineal en menos de 1 h para todas las longitudes de ADN de entrada analizadas en esta investigación. Descubrimos que agregar solo exonucleasa T5 a la reacción de ligadura resultó en una tasa de digestión muy lenta debido a la ausencia de iones de potasio. El papel de NEBuffer 4 es proporcionar aniones de potasio que aceleran las reacciones de exonucleasa. Si bien la concentración de potasio en la mezcla resultante es la mitad de la mezcla de reacción exclusivamente NEBuffer 4, se mantiene cerca de la concentración óptima para las reacciones de escisión45. El equilibrio óptimo entre la actividad de exonucleasa y endonucleasa para la exonucleasa T5 se encuentra en el pH de reacción de 7,9 a 8,046. Este es el pH de NEBuffer 4, mientras que el pH del tampón de ligación es 7,5. Por lo tanto, se agregó una cantidad adecuada de base Tris para aumentar el pH a este rango, como se presenta en la Tabla 2 (artículo principal). En particular, no se recomienda aumentar excesivamente el pH de la mezcla de reacción de exonucleasa T5. Cuando probamos aumentos de pH por encima de 8,5, todo el ADN, incluido el ADN circularizado, se digirió completa y rápidamente.

Limpieza del ADN circularizado. Este paso implica el uso de un kit de limpieza de ADN de calidad para extraer ADN de vector circular de suficiente concentración y pureza. Utilizamos un kit de columna giratoria, que se seleccionó como se describe a continuación. Con una gran cantidad de tales productos disponibles, la elección del kit depende de la preferencia del investigador; sin embargo, el rendimiento puede variar. Nuestro objetivo era seleccionar un kit de extracción simple basado en una columna de centrifugado que proporcionara un alto rendimiento constante, un bajo nivel de impurezas y una concentración de ADN suficientemente alta para mediciones precisas y consistentes. Esta pureza fue importante para el uso directo de los vectores circulares en la transfección de cultivos celulares y para la precisión de las mediciones de concentración y rendimiento informadas por este estudio. Se revisaron varios kits y, a continuación, se probaron y evaluaron tres kits en cuanto a su eficacia en la extracción de ADN y la baja contaminación salina caotrópica: Takara Bio NucleoSpin Gel and PCR Cleanup 740609.5047, QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit 2810648 y NEB Monarch PCR & DNA Kit de limpieza T1030S49.

En base a una prueba de validación con el mismo conjunto de productos de PCR, se eligió el kit QIAquick debido a que tiene la mejor recuperación de ADN de entrada a salida en comparación con los otros dos kits (20 % mejor que NucleoSpin y 30 % mejor que NEB) y exhibir una cantidad baja de sales caotrópicas capturadas cuando se prueba una limpieza de producto de PCR en blanco sin ninguna entrada de ADN. Además, aunque el kit QIAquick clasifica 30 μl como un volumen de elución mínimo, se desempeña con un buen compromiso de rendimiento y concentraciones de ADN más altas y muestra una pureza excelente cuando eluye con volúmenes inferiores a 20 μl, que era preferible para nuestros experimentos de validación de edición principal. . El QIAquick PCR Purification Kit ha demostrado ser muy confiable y consistente, con solo un valor atípico que tuvo aproximadamente la mitad del rendimiento observado en todo el conjunto de experimentos. Este resultado atípico puede deberse a un defecto en la columna de centrifugado; por lo tanto, la muestra fue descartada.

El kit QIAquick incluye un indicador de pH opcional que se recomienda agregar al tampón de unión debido a su importancia para maximizar el rendimiento de ADN. El reactivo indicador nos permite verificar si el pH de la mezcla es óptimo para la unión. En particular, determinamos que era necesario ajustar el pH mediante la adición de uno o más 10 μl de acetato de sodio 3M pH = 5,2, según lo recomendado por QIAGEN48.

Se prestó especial atención a minimizar las pérdidas de pipeteo. La cantidad de ADN de entrada se ajustó para dar como resultado un producto de ADN de salida en el rango de 2 a 4 μg, lo que proporcionó una cantidad suficiente del producto de ADN final para la medición y la prueba. En casos extremos, la cantidad de dsDNA de entrada para el vector circular de 1782 pb tuvo que escalarse hasta 27 μg, lo que aún resultó en un rendimiento de solo 1,3 a 1,7 μg, mientras que una cantidad de ADN de entrada de 6 a 9 μg fue suficiente en 450 Rango de –950 pb. Este bajo rendimiento, que requeriría una alta entrada de ADN y el uso de grandes cantidades de reactivos para producir suficiente producto, indica que los vectores circulares largos no son prácticos para sintetizar. Preferiblemente, nuestro objetivo era lograr una concentración de ADN de salida muy superior a 80 ng/μl, lo que daría como resultado un ADN de alta pureza basado en proporciones de 260/230 y 260/280. Esto se vio favorecido adicionalmente al realizar un paso de lavado adicional al usar los kits de purificación, lo que dio como resultado una salida de ADN consistentemente pura con un sacrificio potencial mínimo en el rendimiento. Las mediciones de concentración de ADN se realizaron principalmente en un espectrofotómetro NanoDrop Eight (ThermoFisher Scientific) y se repitieron en un espectrofotómetro/fluorómetro serie DS-11 (DeNovix). En particular, las concentraciones medidas coincidieron estrechamente entre estos dos dispositivos.

La extracción de la banda 1 para probar el rendimiento de edición de genes del vector circular único puro sin duplicados se realizó mediante separación de ADN mediante electroforesis en geles de agarosa E-Gel EX al 1 % (Invitrogen). El ADN del vector circular se limpió con el kit de extracción de gel de ADN Monarch (T1020S) con un paso de lavado adicional.

La relación de rendimiento máxima posible de la reacción de circularización se calcula dividiendo la longitud del ADN circularizado, según lo determinado por los sitios de corte de la enzima de restricción en función de la longitud del ADNds de entrada. Por lo general, una enzima de restricción de tipo IIS requiere seis pares de bases o más entre ella y el extremo de la hebra de dsDNA para garantizar un corte eficiente. También se descartan el propio sitio de reconocimiento de la enzima de restricción, un desplazamiento entre el sitio de reconocimiento y la ubicación del corte, y una longitud del saliente. Para nuestro manejo, fue conveniente conservar los adaptadores finales Twist Bioscience, que tienen una longitud de 22 pb y se pueden usar con los cebadores Twist Bioscience para la amplificación por PCR de estos fragmentos de ADN. En este caso, el máximo denominador posible de la relación de rendimiento es la longitud del dsDNA pedido a Twist Bioscience más 44 pb. Todos los elementos se pueden explicar formalmente mediante la siguiente ecuación:

donde R es la relación de rendimiento máximo, Lc es la longitud del ADN circularizado, Lenz_site es el sitio de reconocimiento de la enzima, Lenz_offset es el desplazamiento entre el sitio de reconocimiento de la enzima y el comienzo del corte, Lcut_length es la longitud del corte (típicamente 4 bp), y Lend_pad es relleno o adaptadores finales (como en nuestro caso), asumiendo que tienen la misma longitud en cualquier extremo. Como ejemplo, para dsDNA entregado por Twist Bioscience con adaptadores para hacer un vector circular de 452 bp, la relación de rendimiento máxima posible es 0,88. Así, si se utilizan como insumo 6 μg de ADN, el rendimiento máximo posible será de 6 * 0,88 = 5,28 μg.

Definimos el multiplicador molar del producto de la reacción de circularización como la relación entre el peso relativo combinado producido por la circularización y la fracción relativa molar de una sola guía circular. Evaluamos los brillos de banda relativos de la imagen de electroforesis en gel, que se procesó con ImageJ de los NIH (consulte la Fig. 3 complementaria para ver el conjunto completo de imágenes de electroforesis en gel sin modificar). Como sabemos el brillo relativo, debemos sumar todos los brillos relativos de la banda, que, por definición, será = 1 dividido por la suma del brillo relativo de cada banda (Ii) dividido por el número i de esa banda. Así, el multiplicador molar M se calcula como:

Las células HEK293T se sembraron en placas de 24 pocillos (Corning) a 140 ⋅ 103 células por pocillo en DMEM suplementado con FBS al 10 %. Aproximadamente 24 h después de la siembra, las células se transfectaron al 60 % de confluencia con 2,0 mL de Lipofectamine 2000 en Optimem (Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante y 800 ng de plásmido editor principal Cas9, con relaciones molares de 4:1 (110 ng para vectores circulares de 452 pb de banda única purificados, 175 ng para vectores circulares de 452 pb y 370 ng para vectores circulares de 952 pb) para cada una de las guías de ubicación (sustitución de base única HBB, CDKL5 y PRNP basada en 15).

Luego, 14 a 16 h después de la transfección, los medios se reemplazaron con DMEM fresco más FBS al 10 % y 6 ng/μl de blasticidina (Thermo Fisher Scientific) para seleccionar las células que contenían el editor principal. Esto fue seguido 24 h más tarde por 6 ng/μl. Luego, se realizó un cambio de medio a las 24 h (basado en una recomendación de Xiong et al.50). El ADN genómico se extrajo 72 h más tarde utilizando un Zymo Research Quick-DNA Microprep Kit (D3020).

Las áreas genómicas de interés se amplificaron a partir de 4 ng de ADN del genoma completo utilizando Q5 High-Fidelity 2x Master Mix (New England BioLabs) en 24–26 ciclos utilizando el protocolo de mezcla maestra (consulte los archivos de datos de disponibilidad de datos para obtener una lista de los cebadores) . A esto le siguió la separación del ADN mediante electroforesis en geles de agarosa E-Gel EX al 1 % (Invitrogen) y el uso de un kit de extracción de ADN en gel Monarch (T1020S) con un paso de lavado adicional. La secuenciación de Sanger fue realizada por Azenta Genewiz utilizando nuestros cebadores de PCR.

El bajo costo del reactivo del protocolo se ejemplifica aquí mediante el desglose de una reacción típica de 50 l. Los reactivos se utilizan en las cantidades enumeradas en la Tabla 2 y la Tabla 3. Las fuentes y los identificadores del fabricante se proporcionan en la Tabla 4. La mayor parte del gasto inherente a los vectores circulares es el costo del dsDNA lineal pedido a un proveedor comercial. Presentaremos los costos para el ejemplo de nuestro Vector Circular de 452 pb. Los precios que pagamos por los reactivos eran los típicos para compradores universitarios minoristas, sin ningún descuento adicional. Con una longitud circularizada de 452 pb, se ordenó un fragmento de dsDNA de 470 pb a Twist Bioscience al precio de lista de $0,07 por par de bases, lo que resultó en un costo de entrada de ADN de $32,90.

Por lo general, Twist Bioscience entregó 1,5–2,0 μg de fragmento de dsDNA. Los costos de los reactivos para un protocolo de 50 μl se presentan en la Tabla complementaria 1, en las cantidades enumeradas en la sección Protocolo paso a paso. La salida planificada es de 2,0 a 2,5 μg de vector circular, que requiere una entrada de 6,0 μg de dsDNA. Dicho rendimiento es suficiente para más de 10 ediciones en una placa de 24 pocillos y ~40 ediciones en una placa de 96 pocillos. El costo de este protocolo de Vector Circular es de $9.30. Si su proveedor puede entregar una cantidad suficiente de fragmentos de ADN, todo corre por su cuenta.

En nuestro estudio, tuvimos que ejecutar un paso de amplificación por PCR (opcional, con un precio en la Tabla complementaria 1), que agregó $ 4.76 al costo. Si solo se necesita una pequeña cantidad de vectores circulares, la reacción se puede reducir a una cantidad menor de ADN disponible, con un menor uso de reactivos y un menor costo resultante.

Todas las reacciones del protocolo se realizaron por duplicado de reacción independiente (n = 2) o por triplicado (n = 3), según se indica, y se promediaron los valores de porcentaje de rendimiento. La electroforesis en gel de las muestras anteriores se analizó utilizando el software ImageJ17 de los Institutos Nacionales de la Salud en duplicados de muestras independientes (n = 2), y se promediaron los valores porcentuales del concatémero resultante.

El análisis de eficiencia de edición realizado a partir de la secuenciación de Sanger usando EditR22,23 de muestras independientes por triplicado (n = 3) o cuadruplicado (n = 4). Los valores P para la eficiencia de edición calculados por EditR fueron P < 5 ⋅ 10−8 para todas las muestras. Los valores de eficiencia de edición se promediaron y los valores de desviación estándar correspondientes se presentan en la Tabla 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen se proporcionan con este documento Datos complementarios 1. Los datos de secuenciación de Sanger se han depositado en la base de datos GenBank con números de acceso que comienzan con OP971846 y terminan con OP971880. Las imágenes de gel sin recortar se presentan en la Fig. 3 complementaria.

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Roman Teo Oliynyk

Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada en la Universidad de Harvard, Boston, MA, EE. UU.

Iglesia de George M.

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RO diseñó y realizó investigaciones; RO y GC analizaron los datos y escribieron el artículo.

Correspondencia a Roman Theo Oliynyk.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Oliynyk, RT, Church, GM Modificación y preparación eficientes de ADN circular para expresión en cultivo celular. Commun Biol 5, 1393 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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Recibido: 15 Agosto 2022

Aceptado: 09 diciembre 2022

Publicado: 21 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04363-z

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