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Jan 06, 2024

Sobre la interacción entre los lípidos y la dinámica asimétrica de un transportador ABC degenerado de NBS

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 149 (2023) Citar este artículo

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Las proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos son exportadores de la familia ABC C. Son cruciales en farmacología ya que transportan varios sustratos a través de las membranas. Sin embargo, el papel del sitio de unión de nucleótidos (NBS) degenerado sigue sin estar claro, al igual que la interacción con el entorno lipídico circundante. Aquí, proponemos una descripción dinámica y estructural de MRP1 desde ca. Simulaciones de dinámica molecular de 110 μs. Es probable que la unión de ATP a NBS1 se mantenga a lo largo de varios ciclos de transporte. El comportamiento asimétrico de NBD está garantizado por una menor transducción de señal de NBD1 al resto de la proteína debido a la ausencia de conformación de rótula entre NBD1 y las hélices de acoplamiento. Aunque los lípidos circundantes juegan un papel activo en la comunicación alostérica entre el bolsillo de unión al sustrato y los NBD, nuestros resultados sugieren que la composición lipídica tiene un impacto limitado, principalmente al afectar la cinética de transporte. Creemos que nuestro trabajo puede extenderse a otras proteínas ABC de NBS degeneradas y proporcionar pistas para descifrar las diferencias mecánicas entre los transportadores ABC.

Los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC) pertenecen a una de las superfamilias de proteínas más grandes del reino trans. La resolución estructural de varios transportadores ABC ha dado lugar a diferentes conformaciones (a saber, orientado hacia adentro—IF, orientado hacia afuera—OF y ocluido), que ilustran el acceso alterno como el modelo más probable para racionalizar la translocación del sustrato a lo largo del ciclo de transporte1, 2,3. Las estructuras del transportador ABC están formadas por al menos dos dominios transmembrana (TMD) que constan de seis hélices transmembrana (TMH). Los TMD están unidos a dos dominios de unión a nucleótidos (NBD) que se conservan evolutivamente entre especies. El ciclo de transporte ABC requiere la unión de dos moléculas de ATP y la energía liberada por la hidrólisis de al menos una de ellas3,4,5,6,7. Las moléculas de ATP se unen en la interfaz del dímero NBD que adopta una disposición de cabeza a cola pseudosimétrica no covalente; permitiendo la formación de dos sitios de unión de nucleótidos (NBS). Ambos NBS están formados por los motivos Walker A y B conservados, los bucles A, Q y H de un NBD y la secuencia de la firma ABC y el bucle X del otro NBD4,5,7,8.

Excepto por unos pocos miembros (es decir, CFTR, ABCA4, ABCD4, SUR1/2)2,3,9,10, los transportadores ABC eucariotas son exportadores, es decir, extruyen sustratos al compartimento extracelular. Los transportadores ABC eucariotas solían clasificarse en familias de tipo I (ABCB, ABCC, ABCD) y tipo II (ABCA, ABCG). Recientemente, las diversidades estructurales y funcionales de los transportadores ABC han llevado a una nueva clasificación basada en el plegado2,3 en la que los anteriores exportadores tipo I y tipo II adoptan los plegados tipo IV y V, respectivamente.

Las proteínas asociadas a la resistencia a múltiples fármacos (MRP) son transportadores ABC degenerados de NBS3,4,5,7,8. En el NBS1 no canónico, el glutamato catalítico de Walker B, la tirosina del bucle A y el primer residuo de glicina del motivo característico ABC se mutan en residuos de aspartato, triptófano y valina, respectivamente. Estas mutaciones se asociaron con una actividad ATPasa significativamente más baja y una mayor afinidad de unión a ATP por el NBS14,7 degenerado. Estas observaciones han llevado recientemente al desarrollo de un nuevo modelo asimétrico para la función NBD que puede afectar la dinámica y la función de todo el transportador3,7. La función y la cinética de ABCC1/MRP1 bovino (bMRP1) se investigaron exhaustiva y minuciosamente mediante la combinación de información estructural de experimentos de criomicroscopía electrónica (crio-EM) y transferencia de energía de resonancia de Förster de molécula única (smFRET)5. A pesar de los sólidos conocimientos proporcionados por la resolución de la estructura de bMRP1, se observaron diferencias inexplicables entre los exportadores ABCB y ABCC, en parte debido al entorno basado en detergente no nativo utilizado para los experimentos de bMRP17,11.

Los transportadores ABC juegan un papel crucial en la farmacología al transportar una gran variedad de sustratos, incluidos xenobióticos y compuestos endógenos, a través de las membranas celulares. Por ejemplo, su función farmacológica ha sido destacada por el Consorcio Internacional de Transporte (ITC), que elabora una lista de transportadores de "importancia clínica emergente" para los que se deben investigar las interacciones con nuevos xenobióticos en el desarrollo de fármacos12. En las últimas décadas, los transportadores ABCC, en los que se incluyen los MRP, han ganado un interés creciente debido a su papel en la farmacología, incluidas las respuestas interindividuales de los pacientes a los tratamientos. Por ejemplo, el ITC ha recomendado investigaciones sobre ABCC2/MRP2 y ABCC4/MRP4 para proporcionar retrospectivamente una explicación mecánica de las observaciones clínicas con respecto a las disposiciones de medicamentos13. Dado el papel de los MRP en las relaciones farmacocinéticas y farmacodinámicas locales (PK/PD) y, por lo tanto, en la biodisponibilidad local del fármaco14, todavía es necesario descifrar el ciclo de transporte de MRP in situ para proporcionar una descripción general completa de los eventos de cruce de membrana de xenobióticos. Esto es particularmente relevante para los MRP ubicados en las células renales tubulares proximales y los hepatocitos hepáticos, ya que los riñones y el hígado están involucrados en la eliminación de la mayoría de los xenobióticos utilizados en todo el mundo15.

Desafortunadamente, todavía no existe una estructura resuelta experimentalmente para los MRP humanos. Se ha propuesto una estructura16 de MRP4 de enhebrado de proteína refinada MD para la cual la resolución computacional impide investigaciones funcionales o dinámica estructural completa. Sin embargo, se han resuelto varias conformaciones del transportador bMRP1 mediante cryo-EM4,5,8. Dada la gran similitud de secuencia con el ortólogo humano hMRP1 (91 %), así como con otros MRP humanos (aprox. 40–50 %), el uso de estructuras de bMRP1 como prototipo parece relevante para investigar la dinámica y las funciones del transportador MRP3. El exportador MRP1 adopta el plegado tipo IV; sin embargo, tiene un TMD N-terminal adicional hecho de cinco TMH. Se demostró que el llamado TMD0 no desempeña ningún papel en la actividad de ABC ATPasa ni en el transporte de sustratos3,4,8. Por lo tanto, un modelo MRP1 sin TMD0 puede usarse como prototipo para exportadores ABCC incluso para aquellos que no poseen este dominio (por ejemplo, MRP4). TMD0 está conectado a los TMD ABC convencionales mediante un enlazador (L0) que demostró ser obligatorio tanto para el tráfico como para la función8,17. La secuencia L0 se conserva en todos los miembros de la subfamilia ABCC incluso en ausencia de TMD08. Es importante señalar que dado que el presente modelo no incluye TMD0, en el presente manuscrito se utilizará el etiquetado TMH estándar para ABC tipo IV, es decir, TMH1 a TMH12.

El presente trabajo tiene como objetivo mapear el espacio conformacional ABC1,18 de MRP1 considerando diferentes estados ligados (a saber, apo, ATP y/o leucotrieno C4—LTX—estados ligados8 para la conformación IF y estado ligado ATP4 para la conformación OF) destacando la importancia de la asimetría en dominios ABC. Además, dada la importancia de los lípidos circundantes en el ciclo de transporte ABCC11,19, también se investigó la interacción entre la bicapa lipídica y la dinámica proteica. Esto se logró mediante el uso de diferentes modelos computacionales de membranas simétricas hechos de (i) POPC puro (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina), (ii) POPE puro (1-palmitoil-2-oleoil-sn -glicero-3-fosfoetanolamina), (iii) POPC:POPE (3:1), (iv) POPC:Chol (3:1) y (v) POPC:POPE:Chol (2:1:1); siendo el último el más cercano a imitar la dinámica MRP1 in situ. Se realizaron simulaciones de dinámica molecular (DM) imparciales a escala de microsegundos de todos los átomos para abordar los objetivos.

Para examinar el espacio conformacional muestreado durante las simulaciones en POPC:POPE:Chol (2:1:1) que representan los estados ligados de bMRP1, se consideraron diferentes descriptores estructurales según estudios previos1,11,18. Es decir, se monitorearon los ángulos intracelulares (IC) y extracelulares (EC) para TMD, mientras que la distancia NBD y el ángulo de giro oscilante NBD se usaron para NBD (Fig. 1 y Figs. Suplementarias 1–6); se sabe que este último se adapta a lo largo de la transición OF-to-IF en ABCB1/P-gp18. Estos descriptores estructurales también se midieron en un gran conjunto de datos de proteínas ABC resueltas experimentalmente, incluidas las estructuras crio-EM bMRP14,5,8 para reconstruir el espacio conformacional ABC1,18 (Fig. 1d y Tabla complementaria 1). Las conformaciones ABC conocidas se destacaron eficientemente, es decir, IF abierto y ocluido, OF así como las conformaciones de volumen de negocios1 asimétricas desbloqueadas (UR) recientemente resueltas. Las simulaciones MD de bMRP1 revelaron el cierre espontáneo de la cavidad intracelular para todos los sistemas IF, independientemente del estado unido y la composición de la membrana (Fig. 1a, b, Figs. 1–6 complementarias y Tablas complementarias 2–5). Las distancias NBD promedio y los ángulos IC fueron significativamente más pequeños que los calculados para las estructuras crio-EM bMRP1. Por ejemplo, las conformaciones IF convergieron hacia valores similares de ángulo IC y distancia NBD que van desde 26,0 ± 0,5 hasta 35,4 ± 1,8 ° y desde 30,3 ± 1,9 hasta 55,0 ± 2,8 Å, respectivamente (Fig. 1b, Figs. complementarias 1, 3–4, y tablas complementarias 3 y 4). Curiosamente, también se observó la dimerización espontánea de los NBD en ausencia de moléculas de ATP. La diferencia entre las simulaciones y la estructura crio-EM podría explicarse parcialmente por el uso de detergente no nativo en los experimentos7,11. De hecho, las estructuras crio-EM resueltas de bMRP1 exhibieron ángulos IC y distancias NBD más grandes que otras estructuras ABC resueltas en entornos nativos (Fig. 1d). En el lado extracelular de la membrana de la bicapa lipídica, las simulaciones MD de OF bMRP1-(ATP)2 mostraron aperturas menores de la puerta EC en comparación con las estructuras crio-EM de bMRP1 OF, lo que sugiere la existencia de un estado ligeramente más abierto. Sin embargo, los ángulos EC calculados se mantuvieron pequeños (menos de 20° en POPC: POPE: Chol (2: 1: 1), consulte la Fig. 1a y las Figs. 1 y 2 complementarias y la Tabla complementaria 2), lo que impide el reingreso del sustrato1 .

Conformaciones orientadas hacia adentro: estado apo (IF apo bMRP1), unido a sustrato (bMRP1-LTX), unido a ATP (bMRP1-(ATP)2), unido a ATP/sustrato (bMRP1-LTX-(ATP)2) ; Conformación orientada hacia el exterior: unido a ATP (OF bMRP1-(ATP)2). a Instantáneas representativas de los diferentes sistemas bMRP1 investigados aquí al principio y al final de las simulaciones MD. b Evolución temporal de los ángulos IC y EC respectivamente para las estructuras IF y OF. Los ángulos IC y EC se calcularon de acuerdo con los parámetros estructurales ABC propuestos definidos en la sección Métodos1,11,18. c Evolución temporal de distancias clave de NBS definidas por distancias inter-NBD entre la glicina Walker A y los residuos de serina característicos de ABC8. d Proyección de parámetros estructurales de bMRP1 en el espacio conformacional ABC obtenido a partir de múltiples estructuras ABC resueltas. Los resultados se obtuvieron de n = 3 trayectorias MD para cada sistema y para las cuales se muestran las desviaciones estándar. Los ID de PDB de las estructuras crio-EM bMRP1 resueltas se mencionan explícitamente. El primer y segundo TMD se representan respectivamente en naranja y azul, y NBD1 y NBD2 se muestran respectivamente en amarillo y cian.

Aunque las trayectorias realizadas con el estado previo a la translocación (es decir, bMRP1-LTX-(ATP)2) tienden a poblar el subespacio conformacional ABC de la conformación OF (Fig. 1d), no se observó la translocación del sustrato. Los valores de torsión NBD calculados para el estado bMRP1-LTX-(ATP)2 son similares a las conformaciones OF ABC. Sin embargo, las distancias NBD siguen siendo mayores que para las estructuras OF ABC sin sustrato resueltas y las simulaciones OF bMRP1-(ATP)2. Se controlaron las distancias entre los átomos de Cα de la serina del motivo característico ABC y una glicina Walker A (es decir, Gly681-Ser1430 y Ser769-Gly1329, respectivamente indicadas como \({d}_{{GS}}^{{NBS}1}\ ) y \({d}_{{GS}}^{{NBS}2}\), Fig. 1c, Figs. complementarias 7–8). Las diferencias estructurales entre los estados previos y posteriores a la translocación (es decir, bMRP1-LTX-(ATP)2 y OF bMRP1-(ATP)2, respectivamente) sugieren que se requiere una transición conformacional del dímero NBD antes del evento de translocación del sustrato . Es probable que dicha transición de las conformaciones de dímero NBD llamadas "no competentes" a "competentes" desencadene transiciones conformacionales de TMD, lo que sugiere que podría ser el paso limitante para la transición de IF a OF.

Las conformaciones de bMRP1 también se pueden documentar sobre la base de la apertura de poros TM (Figuras complementarias 9-13). Como era de esperar, el poro TM es más grande para OF bMRP1-(ATP)2 en la hoja superior (en z = 18 y 5 Å por encima del centro de la bicapa lipídica, figuras complementarias 10-11) mientras que las conformaciones IF permanecen cerradas. Curiosamente, se observó una forma de cuello de botella para la conformación IF a 5 Å. A pesar de la variabilidad dinámica observada para los perfiles de radio de TM en el velo inferior, se observó la siguiente secuencia en términos de apertura (Figs. 12-13 complementarias): IF apo bMRP1 > IF bMRP1-(ATP)2 > IF bMRP1-( LTX) ≈ SI bMRP1-LTX-(ATP)2 > OF bMRP1-(ATP)2. Esto está en consonancia con el papel del sustrato que se demostró que se une a los paquetes de TM en los transportadores ABC18, incluido bMRP14,5. En contraste con el ángulo IC y la distancia NBD que tienden a disminuir rápidamente en la etapa inicial de las simulaciones MD, los radios de poro TM en profundidades seleccionadas en la bicapa lipídica permanecen relativamente constantes a lo largo de las simulaciones.

Las flexibilidades generales se evaluaron calculando las fluctuaciones de la raíz cuadrada media (RMSF, figura complementaria 14). La RMSF por residuo confirma el comportamiento asimétrico de NBDs7, siendo NBD2 más flexible que NBD1. Para cada sistema, se realizaron análisis de componentes principales (PCA) basados ​​en la red troncal. Solo se consideraron los tres primeros componentes principales más grandes, que revelaron del 85,6% al 95,9% de las variabilidades estructurales generales según el sistema (Figura complementaria 15). Para todas las simulaciones de IF, las tres primeras variaciones más grandes se asignaron sistemáticamente a movimientos NBD asimétricos para los cuales NBD2 contribuyó más, del 27,0 al 59,6% del movimiento (Fig. 16 complementaria). Los primeros componentes principales se asignaron principalmente a movimientos giratorios y oscilantes NBD (Películas complementarias 1–5). Esto está de acuerdo con la mayor flexibilidad sugerida experimentalmente de los NBD de los experimentos smFRET a lo largo del ciclo cinético de MRP15. Con respecto a las simulaciones de OF, los dos primeros componentes principales se asociaron con el movimiento de torsión NBD concertado y la apertura del lado extracelular mediado principalmente por TMH4, TMH5, TMH7 y TMH8. Se ha sugerido que estos TMH se comportan como un solo paquete en ABCB1/P-gp18. Además, en menor medida que para las conformaciones IF, NBD2 permaneció más involucrado en este movimiento compartido que NBD1.

El comportamiento asimétrico también fue representado por el arreglo supramolecular entre NBD1 y NBD2 para el cual se observaron dos subpoblaciones principales para los estados apo, bMRP1- (ATP) 2 y bMRP1-LTX (Fig. 2a). Curiosamente, las interacciones dentro de los NBS a través de los NBD se mantuvieron a lo largo de nuestras simulaciones de MD, incluso en ausencia de moléculas de ATP. Se observaron dos conformaciones de NBD, disposiciones de dímero de NBD asimétricamente abiertas o cerradas, a favor de la última. Sorprendentemente, también se observaron ambos arreglos, pero en menor medida, en bMRP1-(ATP)2, aunque se esperaba que las moléculas de ATP mantuvieran interacciones en la interfaz del dímero NBD. En presencia de moléculas tanto de sustrato como de ATP, solo se observó la población cerrada que representaba la transducción de información desde el bolsillo de unión al sustrato TMD a los NBD para probablemente disminuir la barrera de energía para la transición de IF a OF en los transportadores ABC plegables de tipo IV20, 21

a Instantáneas representativas que representan las conformaciones abiertas y cerradas de los dímeros NBD observados durante las simulaciones MD. IF apo bMRP1, bMRP1-(ATP)2 y bMRP1-LTX revelaron dos subpoblaciones principales para las cuales las flechas negras resaltan el movimiento; mientras que las conformaciones previas y posteriores a la translocación (es decir, bMRP1-LTX-(ATP)2 y OF bMRP1-(ATP)2) exhibieron solo la conformación de dímero NBD cerrado. NBD1, NBD2 y las hélices de acoplamiento se representan respectivamente en amarillo, cian y rosa. b Paisajes conformacionales locales dependientes del sistema obtenidos del enfoque basado en GMM desarrollado en el método InfleCS23,64 que destaca la influencia de los nucleótidos y el sustrato en la dinámica estructural de bMRP1. c Potenciales de Coulomb y van der Waals promediados calculados entre nucleótidos y NBS1 y NBS2, por separado (se usaron 800 puntos para cada réplica, tratados de forma independiente; las barras de error muestran las desviaciones estándar). d Redes de enlaces H calculadas entre ATP y NBS1 o NBS2 y entre LTX y residuos de bolsillo de unión al sustrato (las fracciones de enlaces H se calcularon de cada réplica de forma independiente y luego se promediaron n = 3; las barras de error muestran la desviación estándar sobre ellas).

Para explicar el comportamiento asimétrico de los NBD, se prestó especial atención a las hélices de acoplamiento (CH) que aseguran la transducción de la señal de los TMD a los NBD20,21. De forma nativa, los transportadores ABC exhiben cuatro hélices de acoplamiento que unen los dominios intracelulares de TMH2/TMH3, TMH4/TMH5, TMH8/TMH9 y TMH10/TMH11. Los llamados CH2-3 y CH10-11 están en contacto con NBD1 mientras que CH4-5 y CH8-9 interactúan con NBD2 (Fig. 2a). Los contactos entre CH y NBD no se modifican con la unión de moléculas de ATP o sustrato (Fig. 17 complementaria). Curiosamente, para un NBD determinado, se puede considerar el llamado "CH débil" (es decir, CH2-3 y CH8-9 para NBD1 y NBD2, respectivamente) para el que solo se observaron unos pocos contactos. Por otro lado, el llamado "CH fuerte" (a saber, CH10-11 y CH4-5 para NBD1 y NBD2, respectivamente) exhibió más contacto con el NBD y para el cual el arreglo de "ball-and-socket" es significativamente menor. más pronunciado que para el "CH débil". Curiosamente, en MRP1 de mamíferos, la secuencia NBD1 exhibe una eliminación de 13 aminoácidos que se asocia con menos contactos e interacciones significativamente más débiles entre CH2-3 y CH10-11 en comparación con CH4-5 y CH8-9 para NBD2 (Fig. 18 complementaria). ). Además, los pocos contactos observados entre CH2-3 y CH10-11 disminuyen ligeramente en presencia de moléculas de ATP, mientras que el patrón de contacto para NBD2, es decir, CH4-5 y CH8-9, se conserva bien independientemente de la presencia de ATP y/o o leucotrieno C4. Esto conduce a la interrupción de los llamados arreglos de "esférica" ​​de CH2-3 y CH10-11 en NBD1 que se espera (i) sea responsable de la apertura asimétrica de NBD antes mencionada y (ii) impida la transducción de información entre TMDs y NBD18.

Las conformaciones IF exhibieron interacciones de dímero NBD más débiles que la conformación OF, lo que explica la mayor flexibilidad general. Del mismo modo, las simulaciones MD revelaron una flexibilidad ligeramente mayor del estado apo de IF en comparación con los sistemas unidos a ATP y/o LTX. Esto está de acuerdo con observaciones previas que sugieren que las interacciones entre TMH o entre NBD están moduladas por la presencia de sustrato y/o moléculas de ATP4,7,8,22. Aprovechando nuestras extensas simulaciones MD imparciales, los subespacios conformacionales explorados se presentaron en términos de energía libre utilizando los métodos de agrupamiento de InfleCS23 (Fig. 2b). Dadas las conformaciones de dímero NBD no competentes antes mencionadas, se prestó atención a los parámetros estructurales NBD, a saber, torsión NBD y distancia NBD. Se observaron mayores variabilidades para las conformaciones IF que conducen a múltiples mínimos plausibles para los cuales la interconversión es posible pero lenta. El subespacio de torsión de NBD que se espera que sea competente frente a la distancia de NBD tiende a llenarse en presencia de una molécula y/o sustrato de ATP. Tal hallazgo destaca el papel central de los eventos de unión de ATP y sustrato en el ciclo de transporte ABCC1. Para descifrar mejor la dinámica del dímero NBD, se obtuvieron redes estructurales24 considerando mapas de contacto (Fig. 19 complementaria) y matrices dinámicas de correlación cruzada (Fig. 20 complementaria). Cada NBD se puede dividir globalmente en dos subdominios, independientemente de la conformación o los estados vinculados impulsados ​​​​por la unión de ATP (Fig. 21 complementaria). De hecho, las supuestas comunidades similares estaban relativamente bien conservadas en las réplicas y los sistemas investigados (Tabla complementaria 6). La primera comunidad está definida por Walker A y B, así como por los bucles A y H. Por otro lado, la segunda comunidad incluye bucles Q y X y la secuencia de firma ABC. Los residuos involucrados en estas comunidades están altamente correlacionados, lo que sugiere que se propagará el desplazamiento de residuos locales tras la unión de ATP. Las dos comunidades pueden considerarse casi independientes; por lo tanto, no se espera que la unión de un ATP tenga un fuerte impacto en los movimientos de la segunda comunidad. Mientras tanto, dada la disposición asimétrica del dímero NBD, se espera que ATP y magnesio vinculen comunidades a través de NBD. Curiosamente, las correlaciones dinámicas en las simulaciones de IF apo exhibieron mayores variabilidades ya que las comunidades podrían dividirse en subcomunidades (Tabla complementaria 7), por lo que se espera que la unión de ATP fortalezca la cooperación estructural dentro y entre los NBD.

Se prestó especial atención a los modos de unión de los ATP mediante la evaluación de los potenciales de van der Waals y Coulomb, así como las redes de enlaces H en los NBS (Fig. 2c, d). Dichos análisis no deben considerarse cuantitativamente debido a la compensación de errores entre los dos potenciales, especialmente en distancias cortas25. Sin embargo, se pueden utilizar para proporcionar sugerencias cualitativas con el fin de comparar las fuerzas impulsoras de unión de ATP. Curiosamente, tanto las interacciones de Coulomb como las dispersivas exhibieron energías menos atractivas para todas las conformaciones IF que OF. Dado que los NBD exhiben una menor flexibilidad en la conformación OF, las posteriores interacciones más estrechas del dímero NBD pueden racionalizarse mediante la disposición local adecuada de las moléculas de ATP en los NBS. Por ejemplo, las distancias de apilamiento π más bajas calculadas entre las moléculas de ATP y los motivos conservados de NBS fueron sistemáticamente más grandes en las conformaciones IF que en las conformaciones OF, lo que llevó a energías de interacción más bajas entre las moléculas de ATP y los residuos de MRP1 (Fig. 2c y Tabla complementaria 8). Sorprendentemente, en las conformaciones IF, NBS1 tiende a exhibir interacciones dispersivas más bajas entre la molécula de ATP y el residuo del bucle A de Trp653 en comparación con Tyr1301 en el bucle A de NBS2, mientras que la superficie espacial aromática del triptófano es más grande que la de la tirosina. Por otro lado, en la conformación OF, las contribuciones dispersivas tienden a ser ligeramente mayores para NBS1 que para NBS2. Las redes de enlaces H entre moléculas de ATP y NBS (Fig. 2d) sugieren una red similar entre NBS para conformaciones IF. La red de enlaces H se conserva sobre las conformaciones IF y OF con respecto a las interacciones con Walker A; sin embargo, los sistemas IF unidos a ATP no exhiben la red de enlaces H esperada con el motivo de la firma como se observa en las simulaciones de OF. Curiosamente, las simulaciones MD sugieren un comportamiento asimétrico entre NBS con respecto a los enlaces H con residuos de glutamina Q-loop, a saber, Gln713 y Gln1374, respectivamente para NBS1 y NBS2. Las distancias calculadas sugirieron que la unión de ATP γ-fosfato a NBS1 Q-loop era más débil que para NBS2 en la conformación OF. El comportamiento opuesto se observó en simulaciones MD para conformaciones IF. Por lo tanto, las simulaciones actuales subrayan que los modos de unión de ATP adecuados en ambos NBS son clave para desencadenar los cambios conformacionales necesarios para la translocación del sustrato.

Se prestó especial atención al bolsillo de unión al sustrato y se comparó con la estructura crio-EM de bMRP1 unida al leucotrieno C48. De acuerdo con los experimentos, el modo de unión del leucotrieno C4 tuvo lugar en los dos llamados bolsillos P y H ("P" y "H" significan respectivamente polar e hidrofóbico). Dada la característica anfifílica del leucotrieno C4, se ha demostrado que las redes de enlaces de Coulomb y H son fundamentales para la unión al sustrato8. Las simulaciones de MD resaltaron los mismos residuos clave que se observaron experimentalmente (Fig. 2d). Por ejemplo, se observaron fuertes puentes salinos entre residuos de arginina (Arg1248, Arg1196 y Arg593, Figs. 2d y 3a) que mantenían al menos dos de los tres grupos carboxilato de leucotrieno en el bolsillo P. Curiosamente, las variabilidades en términos de fracciones de enlaces H o energías de interacción (Fig. 2d y Fig. 22 complementaria) sugieren un modo de unión dinámico de acuerdo con su ruptura esperada a lo largo de los cambios conformacionales a gran escala de IF a OF.

un bolsillo de unión al sustrato destaca residuos importantes de la unión del leucotrieno C4. También se muestra la estructura del leucotrieno para el que se destacan las características anfifílicas. b Definición de la vía alostérica investigada en el presente estudio para la cual NBS1 y NBS2 se trataron por separado. c Eficiencias alostéricas calculadas del flujo de información entre el bolsillo de unión al sustrato y NBS1 (rojo) o NBS2 (azul) para los diferentes sistemas integrados en POPC: POPE: Chol (2: 1: 1). Las líneas continuas, discontinuas y punteadas representan, respectivamente, las eficiencias teniendo en cuenta: Proteína + lípidos + nucleótidos/sustrato, Proteína + nucleótidos/sustrato y Proteína independiente. Los errores estándar se muestran como sombras y se calcularon a partir de n = 3 réplicas tratadas de forma independiente para cada sistema. d Las contribuciones de proteínas y lípidos al flujo de información para la comunicación alostérica desde el bolsillo de unión al sustrato hasta NBS1 y NBS2 muestran que NBD2 y sus hélices de acoplamiento (CH4-5 y CH8-9) están sistemáticamente involucrados independientemente de la región del sumidero.

Aunque las diferencias en términos de energías de interacción y redes de enlaces H entre bMRP1-LTX-(ATP)2 y bMRP1-LTX o bMRP1-(ATP)2 permanecieron bajas, sugieren un efecto distante entre las NBS y el bolsillo de unión al sustrato. El efecto alostérico se evaluó entre el bolsillo de unión al sustrato y NBS1 y NBS2, de forma independiente (Fig. 3b). Esto se logró al considerar los residuos clave para cada sitio de unión (Tabla complementaria 9) para los análisis de redes de vías alostéricas26,27. Las eficiencias (Fig. 3c) se calcularon en presencia o ausencia de sustrato y moléculas de ATP. También se consideró el impacto de la bicapa lipídica POPC:POPE:Chol (2:1:1). De forma nativa, el bolsillo de unión al sustrato y los NBS están conectados alostéricamente a través de la proteína, como lo muestran las eficiencias calculadas sin incluir nucleótidos ni sustratos. Como era de esperar, la presencia de moléculas de sustrato y/o ATP aumentó sustancialmente la comunicación alostérica desde el bolsillo de unión del sustrato a ambos NBS. Curiosamente, a pesar de la dinámica asimétrica del NBD antes mencionada, los cálculos actuales no mostraron una diferencia significativa en términos de eficiencia entre los NBS. Las intermediaciones se calcularon para representar las contribuciones de residuos y dominios a la vía alostérica (Fig. 3d y Figs. Suplementarias 23-25). Se prestó especial atención a los sistemas unidos a ATP, es decir, IF bMRP1-(ATP)2 y bMRP1-LTX-(ATP)2 así como OF bMRP1-(ATP)2 (Fig. 4d), otros sistemas se informan en Fig. 26 complementaria. Los principales residuos involucrados en las vías alostéricas de NBS de bolsillo de unión se encuentran principalmente en la parte intracelular de los TMH. Curiosamente, se observó nuevamente un comportamiento asimétrico, en el que TMH4, TMH5, TMH7 y TMH8 están significativamente más involucrados que TMH1, TMH2, TMH10 y TMH11. bMRP1 exhibe una característica asimétrica con respecto a los llamados arreglos de "bola y casquillo" que se demostró que es responsable de la cooperación estructural entre TMH y NBD a través de hélices de acoplamiento8. La eliminación de trece aminoácidos en NBD1 conduce a una menor cooperación entre TMH1, TMH2, TMH10 y TMH11 con NBD1, lo que a su vez disminuye la comunicación alostérica entre el bolsillo de unión al sustrato y NBS1. Además, nuestros cálculos sugieren que la información pasa principalmente a través de NBD2, ya que la comunicación directa con NBD1 se ve significativamente debilitada por la ausencia de conformación de "esférica" ​​para CH10-118. Curiosamente, también se demostró que la bicapa lipídica POPC: POPE: Chol desempeña un papel clave en la comunicación alostérica entre el bolsillo de unión al sustrato y los NBS (Fig. 3c). Sin embargo, a pesar de que su impacto es significativo, las contribuciones de la bicapa lipídica parecen ser más leves que, por ejemplo, en los transportadores de membrana de la superfamilia de facilitadores principales28.

a Ángulo IC promedio, ángulo EC y distancia NBD para todos los sistemas bMRP1 integrados en diferentes bicapas lipídicas calculados a partir de n = 3 trayectorias MD por estado y bicapa lipídica. La barra de error se refiere a las desviaciones estándar de cada conjunto de datos. b Parámetros de orden de cola de lípidos (SCD) del átomo de C calculados para colas palmíticas (sn1) y oleicas (sn2) para todos los sistemas integrados en modelos basados ​​en POPC. Las líneas continuas, discontinuas y punteadas representan respectivamente los parámetros de orden de lípidos obtenidos en los modelos de bicapa lipídica POPC:POPE:Chol (2:1:1), POPC:Chol (3:1) y POPC. La barra de error se refiere a las desviaciones estándar de cada conjunto de datos calculado. c Deformaciones de energía libre de membrana calculadas30 obtenidas promediando sobre n = 3 trayectorias MD, considerando cada réplica de forma independiente. Los datos sin procesar están disponibles en las tablas complementarias 10–12. Las barras de error se refieren a la desviación estándar sobre las tres réplicas independientes. d Puntos calientes de unión calculados obtenidos a partir de colesterol y lípidos PE definidos por una probabilidad de presencia superior al 80 y 50 % respectivamente para colesterol y lípidos PE. Zoom en el colesterol resuelto Cryo-EM (violeta) se muestra para resaltar la orientación paralela específica con respecto a la bicapa lipídica. e Áreas lipídicas importantes basadas en el análisis de la vía alostérica. Se muestra la ubicación de las moléculas de colesterol clave involucradas en la comunicación alostérica entre el bolsillo de unión al sustrato y los NBS. Se consideran ambos NBS, destacando los roles centrales esperados de las regiones L0, pre-TMH1 y pre-TMH7 en interacciones específicas de lípidos y proteínas que podrían favorecer la función de bMRP1.

Dado que en la actualidad se ha prestado más atención a la interacción entre el entorno lipídico circundante11,19,22,26,28 y las proteínas de membrana, se investigaron la dinámica de las proteínas dependientes de los lípidos y las interacciones lípido-proteína. Esto se logró mediante la realización de simulaciones MD en diferentes bicapas lipídicas, a saber, POPC, POPC:Chol (3:1), POPC:POPE:Chol (2:1:1). Los sistemas IF apo bMRP1 y OF bMRP1-(ATP)2 también se consideraron en bicapas lipídicas POPE y POPC:POPE (3:1) poco realistas.

La proyección de parámetros estructurales dependientes de lípidos en el espacio conformacional ABC (Figs. 1, 27 y 28 complementarias) reveló que la mayoría de las simulaciones presentes tienden a explorar subespacios ABC similares independientemente de la composición de la membrana de la bicapa lipídica. La Figura 4a compara los promedios de parámetros estructurales según las composiciones de bicapa lipídica para todas las simulaciones MD realizadas en el presente estudio. Para las conformaciones IF, solo los parámetros estructurales intracelulares (es decir, el ángulo IC y la distancia NBD) exhibieron ligeras desviaciones según la composición lipídica. Los sistemas realizados en bicapa lipídica POPC pura exhibieron conformaciones ligeramente más abiertas. Por otro lado, nuestros cálculos sugieren que solo el ángulo EC se ve afectado por la composición de la bicapa lipídica, pero solo por las conformaciones OF. Del mismo modo, los radios de cavidad calculados (Fig. 9 complementaria) exhibieron pequeñas diferencias al comparar las composiciones de bicapa lipídica. Incluso si estos cálculos subrayan un impacto general relativamente limitado de la composición de la membrana al comparar las estructuras de bMRP1 en diferentes modelos de bicapa lipídica, no representaron suficientemente la variabilidad dinámica en las simulaciones y réplicas de MD (Figuras complementarias 1–6 y 9).

Se calcularon paisajes conformacionales dependientes de lípidos (Figuras complementarias 29 y 30). Para una conformación y un estado de unión dados, las simulaciones MD poblaron preferentemente regiones similares independientemente de la composición de lípidos. Sin embargo, se demostró que la variabilidad estructural se ve significativamente afectada por la composición lipídica. Por ejemplo, en la bicapa lipídica de POPC pura, se muestrearon subespacios de conformación IF más abiertos, con una distancia de 30 a 55 Å NBD. Sin embargo, este efecto se redujo en presencia de sustrato que se espera que tienda a mantener más contactos entre los TMH y, por lo tanto, reduzca la apertura intracelular. Las simulaciones MD realizadas en POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) exhibieron una región muestreada significativamente más pequeña, lo que sugiere que la presencia de lípidos PE tiende a cerrar la puerta intracelular de las conformaciones bMRP1 IF, independientemente del estado unido. Por otro lado, en cuanto a las conformaciones OF y la apertura extracelular, se observaron mínimos globales en el mismo subespacio del espacio conformacional que las simulaciones MD realizadas en POPC puro y POPC:Chol (3:1). Sugiere un impacto limitado del colesterol en la apertura de la puerta EC de bMRP1. Sin embargo, la presencia de lípidos PE desplazó ligeramente los mínimos calculados hacia estructuras OF más abiertas, de 13,9 a 18,5°. Se midieron los ángulos de inclinación entre los TMH y la bicapa lipídica normal para desentrañar ligeras diferencias entre las distintas composiciones de bicapa lipídica (Fig. 31 complementaria). Aunque no se pueden extraer conclusiones claras de estos análisis, las orientaciones de TMH3, TMH6 y TMH9 parecen más sensibles en ausencia de colesterol. Al considerar que los TMH actúan como paquetes, como se muestra para ABCB1/P-gp18, el impacto de la membrana de la bicapa lipídica fue más pronunciado en las orientaciones de inclinación de los paquetes más pequeños (Fig. 32 complementaria), a saber, el paquete C y D, respectivamente, que consisten en TMH3/ TMH6 y TMH9/TMH12. Curiosamente, se espera que estos paquetes sufran cambios conformacionales más grandes a lo largo del ciclo de transporte18. Esto sugiere que aunque la composición de lípidos parece tener un impacto bastante limitado al comparar las estructuras de los mínimos locales de bMRP1 en diferentes membranas de bicapa lipídica, se espera que la composición de lípidos afecte las transiciones conformacionales y, por lo tanto, desempeñe un papel en la cinética del sustrato. transporte por bMRP1.

Para comprender mejor la interacción entre la bicapa lipídica y bMRP1, se prestó especial atención a la estructura de la membrana de la bicapa lipídica. La mayor variabilidad estructural en la membrana POPC pura se explicó por una estructura de bicapa lipídica significativamente más fluida representada por parámetros de orden inferior (SCD) para las colas de palmitato y oleato (Fig. 4b). De acuerdo con la biofísica de las bicapas lipídicas puras, la presencia de colesterol modula la fluidez de la POPC aumentando el orden de los lípidos, lo que a su vez conduce a una menor flexibilidad de la membrana de la bicapa lipídica29. En menor medida, la presencia del lípido PE potenció el efecto estructural del colesterol, lo que está de acuerdo con la variabilidad estructural ligeramente menor de bMRP1 en POPC:POPE:Chol (2:1:1) en comparación con otras membranas de bicapa lipídica. Los cálculos del orden de los lípidos también sugieren un impacto débil de la dinámica de las proteínas en las estructuras de la bicapa lipídica. De hecho, las simulaciones MD de IF apo y OF bMRP1-(ATP)2 exhibieron perfiles de cola de lípidos ligeramente menos ordenados que IF bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2 y bMRP1-LTX-(ATP)2. Esto puede explicarse por una mayor variabilidad de las aberturas intracelulares y extracelulares para la conformación IF y OF, respectivamente, lo que a su vez probablemente conduzca a desplazamientos más pronunciados de los lípidos circundantes. También se evaluaron las deformaciones de energía libre de membrana30 para documentar el impacto de las conformaciones de bMRP1 en las estructuras de bicapa lipídica (Tablas complementarias 10-12 y Fig. 4c). Si bien los cálculos sugieren que la presencia de bMRP1 desestabiliza la estructura de bicapa lipídica de POPC pura, la tendencia opuesta se observó de manera interesante en POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) en el que la membrana se estabiliza en presencia de bMRP1 (ΔG deformación < 0, ver Fig. 4c). Se observó un comportamiento intermedio en la membrana de bicapa lipídica POPC:Chol (3:1) para la cual la presencia de bMRP1 desestabilizó globalmente la estructura de la bicapa lipídica pero en un grado significativamente menor que en la POPC pura. Excepto por las simulaciones realizadas en bicapa lipídica POPC pura, las energías libres de deformación calculadas son mayores para el estado IF apo bMRP1 que para otras conformaciones, probablemente debido a su mayor flexibilidad antes mencionada en ausencia de ATP y/o sustrato.

Los análisis de densidad bidimensional dependientes de lípidos, así como la evaluación de la distribución de los lípidos circundantes, revelaron importantes puntos críticos de colesterol y lípidos de PE. Por ejemplo, se demostró que los lípidos de PE se unen preferentemente a la hélice del codo pre-TMH7, así como cerca del dominio L0, durante más del 50 % de la simulación (Fig. 4d, perfiles de densidad 2D calculados en las Figs. 33–36 complementarias) . Los mapas de densidad electrónica revelaron tres moléculas de colesterol unidas a la estructura OF bMRP1 resuelta, de las cuales dos se mantuvieron cerca de su posición inicial con una probabilidad superior al 50% (Fig. 33 complementaria). Curiosamente, uno por el pre-TMH7 se mantiene fuertemente (más del 80%) a lo largo de las simulaciones MD, estando orientado en línea con la hélice del codo pre-TMH7, es decir, paralelo a la bicapa lipídica (Fig. 4d). Este punto caliente de colesterol anterior a TMH7 también se observó, por ejemplo, en simulaciones de IF apo POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) (Fig. 4c). En menor medida, una segunda molécula de colesterol resuelta permanece en contacto con la proteína, por la hélice del codo pre-TMH1 (Fig. 33 complementaria). Curiosamente, este punto de acceso casi pseudosimétrico en comparación con la hélice del codo anterior a TMH7 también se observó en simulaciones realizadas con conformaciones IF bMRP1 (Fig. 4d). Los análisis de la vía alostérica subrayaron el papel clave de las moléculas de colesterol cercanas a las hélices del codo pre-TMH1 y -TMH7 en la transducción de información desde el bolsillo de unión al sustrato a los NBS, como se muestra en la Fig. 4e. De hecho, la intermediación calculada de estas moléculas de colesterol sugirió claramente que participan activamente en la comunicación alostérica desde el sitio de unión del sustrato a las NBS. Finalmente, la última molécula de colesterol resuelta observada en la interfaz entre TMH5 y TMH8 no permanece en contacto con el núcleo de la proteína a lo largo de las simulaciones MD. Sin embargo, los perfiles de densidad 2D calculados del colesterol sugieren una probabilidad levemente mayor de presencia de colesterol en esta región, lo que sugiere que la molécula resuelta se intercambió a lo largo de la simulación MD. Además, dichos perfiles también revelaron puntos de mayor densidad, como la molécula de colesterol orientada horizontalmente por TMH4 (Figs. 35–36 complementarias).

bMRP1 es el único miembro de la familia C de exportadores de fármacos ABC que ha sido resuelto mediante crio-EM hasta el momento, dado que ABCC7/CFTR es un canal de cloruro31 y los receptores de sulfonilureas (ABCC8 y ABCC9) están involucrados en la regulación de los canales de potasio32. Durante la última década, se ha prestado especial atención a los transportadores de MRP, incluidos MRP1, MRP2 y MRP4, dadas sus funciones clínica y farmacológicamente relevantes en la disposición de fármacos, como lo señala el ITC12,13. A diferencia de su primo ABCB1/P-gp, el conocimiento sobre la dinámica y las funciones de MRP1 aún permanece fragmentado, aunque se ha resuelto en múltiples estados, como IF apo y estados unidos al sustrato8 y dos estados OF en pre-4 y post-hidrólisis5 conformaciones, unidas respectivamente a dos moléculas de ATP o al par ADP/ATP. En el presente trabajo, se realizó un amplio conjunto de simulaciones MD de todos los átomos para capturar la dinámica conformacional de bMRP1 en diferentes estados considerando diferentes mezclas de modelos de bicapa lipídica que incluyen lípidos PC y PE, así como colesterol. Proponemos un enfoque computacional basado en MD para (i) completar las observaciones experimentales realizadas en detergentes y (ii) resaltar patrones estructurales que podrían extenderse, al menos, a otros transportadores de la familia ABC C.

La dinámica conformacional global en POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) muestra variaciones significativas de las estructuras IF con respecto a las estructuras crio-EM. En los estados IF, se observó sistemáticamente el cierre espontáneo de los NBD, independientemente de la presencia de moléculas de ATP, como se muestra en los valores del ángulo IC y la distancia NBD, que convergieron todos hacia el mismo subespacio. Con respecto al espacio conformacional ABC, la presencia de moléculas de ATP en ambos NBS o sustrato en el bolsillo de unión de TMD cambia principalmente la dinámica de la dimerización de NBD al modular el valor de torsión de NBD (Fig. 2b y Fig. 5 complementaria). Por lo tanto, nuestras simulaciones MD están en perfecto acuerdo con las observaciones recientes6,7 de que las estructuras IF abiertas pueden ser poco probables en entornos de membrana nativos. Por lo tanto, se cree que las estructuras abiertas observadas en los experimentos crio-EM se deben a artefactos debido al uso de entornos no fisiológicos para la resolución de la estructura7, de acuerdo con las diferencias estructurales observadas, por ejemplo, para P-gp reconstituida en detergentes o en nanodiscos11 . La eliminación de 13 aminoácidos de NBD1, como la ausencia de la estructura de "bola y cavidad" para NBD1, podría debilitar el acoplamiento entre NBD1 y TMH10/TMH11. En ausencia de sustrato, esto se asocia con una mayor flexibilidad de traducción con respecto a NBD1 que conduce a la apertura del dímero NBD. Sin embargo, en presencia de moléculas de ATP y sustrato, solo se observaron conformaciones de dímero NBD cercanas (Fig. 2a), lo que destaca la comunicación alostérica entre los TMD y ambos NBS. Debido al menor acoplamiento entre TMH10/TMH11 y NBD1, se espera que la alostería entre TMD y NBD esté mediada principalmente a través de NBD2. Curiosamente, NBS1 también se formó incluso en ausencia de moléculas de ATP (Fig. 2a). Esto también podría explicar por qué las transiciones de IF a OF se observaron experimentalmente incluso en ausencia de moléculas de ATP5. Sin embargo, tales suposiciones deben considerarse cuidadosamente dada la reciente resolución de un transportador ABC degenerado de NBS que adopta una conformación IF abierta por medio de crio-EM usando nanobodies33. Nuestros resultados destacan la importancia de la asimetría de NBD y NBS como una evolución de los transportadores ABC que puede resultar del ahorro de energía mientras se mantiene la función de transporte al requerir una sola hidrólisis de ATP.

Se espera que MRP1 lleve principalmente sustratos anfifílicos aniónicos, a diferencia de la P-gp, que transporta principalmente sustratos hidrofóbicos2. De acuerdo con las observaciones estructurales, el acceso al sustrato directamente desde las regiones de cola de lípidos de alta o baja densidad de la membrana es muy poco probable debido a la ausencia de un canal de acceso en la bicapa lipídica contrario a P-gp8. Sin embargo, los sustratos anfifílicos podrían dividirse en la región de la cabeza polar de alta densidad. Por lo tanto, se espera que el acceso al sustrato de MRP1 ocurra directamente desde el citoplasma o desde la región de la cabeza polar de alta densidad, para la cual el acceso podría ser posible a través de TMH4 y TMH6 (Fig. 37 complementaria). Por otro lado de bMRP1, nuestras simulaciones MD sugieren que el acceso al sustrato entre TMH10 y TMH12 puede ser menos probable para sustratos voluminosos. Sin embargo, tales suposiciones requieren más investigaciones bioquímicas y estructurales.

En el presente trabajo, también investigamos la interacción entre las membranas de bicapa lipídica y la dinámica de proteínas. Primero, es importante tener en cuenta que las simulaciones actuales se realizaron durante unos pocos μs para cada réplica. Dada la escala de tiempo de los procesos de transporte, los resultados actuales solo pueden usarse para descifrar la interacción lípido-proteína en las regiones de equilibrio de los diferentes estados conformacionales. Al jugar con diferentes modelos de bicapa lipídica, como membranas sin colesterol y sin PE, se modula la dinámica de bMRP1. De acuerdo con estudios biofísicos previos, la presencia de colesterol en la membrana basada en PC aumentó la rigidez de la membrana, lo que a su vez redujo la dinámica conformacional de MRP129. Se espera que el impacto de los lípidos de PE en las estructuras mínimas locales sea bastante limitado para los estados de IF. Sin embargo, curiosamente, la apertura de EC bajo la conformación OF parecía más favorable en presencia de PE (Fig. 4a). A nivel mundial, nuestros resultados también sugieren que es probable que la estructura de MRP1 adopte una estructura similar para un estado dado, independientemente de la composición de la bicapa lipídica. Sin embargo, esto puede desempeñar un papel en las transiciones y cinéticas conformacionales. Esta hipótesis debe considerarse cuidadosamente para otros transportadores MRP. De hecho, en contraste con, por ejemplo, MRP2 y MRP4, MRP1 es un exportador ubicuo que se observó en diferentes tipos de células para las que la composición de la bicapa lipídica podría diferir. Por lo tanto, podemos inferir que otros miembros de MRP podrían volverse más sensibles a las composiciones de membrana de bicapa lipídica.

Fuera del papel físico de la bicapa lipídica en la dinámica de las proteínas, nuestros resultados respaldan que los componentes lipídicos también juegan un papel activo en la función del transportador. De acuerdo con las observaciones computacionales realizadas en otras proteínas de membrana11,26,34,35, los componentes lipídicos están involucrados en la alostería de TMD a NBD. Más importante aún, el colesterol se une a las hélices del codo pre-TMH1 y pre-TMH7 que están fuertemente involucradas en estas vías alostéricas. Dichos hallazgos allanan el camino con respecto al papel del motivo pre-TMD de lazo (L0), que se demostró que es necesario para la función de transporte de MRP18,17. Incluso si el papel de los lípidos puede parecer limitado en MRP1 en comparación con otros receptores y canales de membrana, se debe prestar más atención a las interacciones lípido-proteína, no solo con respecto al impacto biofísico en la dinámica de la proteína sino también como modulador del transporte, como se propuso recientemente para P-gp11.

El presente trabajo proporcionó conocimientos estructurales sobre la función y la interacción lípido-proteína de los transportadores ABCC degenerados de NBS para futuras investigaciones, como el papel de los MRP en la farmacocinética local, incluido, por ejemplo, el impacto de mutaciones raras/polimorfismo, así como la membrana basada en enfermedades. desequilibrio lipídico hacia la medicina personalizada.

Para tener una visión general de las estructuras de los hitos a lo largo del ciclo de transporte de bMRP1, en el presente estudio se consideraron diferentes conformaciones y estados ligados: IF apo bMRP1, IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX, IF bMRP1-LTX- (ATP)2 y OF bMRP1-(ATP)2. Las estructuras crio-EM se usaron como estructuras iniciales para las conformaciones IF (PDB ID: 5UJ98 y 5UJA8) y OF (PDB ID: 6BHU4). La conformación de OF se resolvió utilizando el mutante E1454Q que demostró reducir la tasa de hidrólisis de ATP, lo que promovió la determinación de la estructura de OF4. Esta mutación se revirtió manualmente para el presente estudio. El llamado TMD0 no se incluyó en los modelos actuales porque ya se ha demostrado que no afecta el transporte del sustrato3,4,8. Sin embargo, se demostró que el llamado dominio de lazo pre-TMH1 (L0) es obligatorio para la función de MRP1, mientras que no se resolvió por completo en ninguna estructura crio-EM MRP18,17. Las partes faltantes del dominio L0 se modelaron utilizando I-Tasser (Refinamiento de ensamblaje de subprocesos iterativos) server36 o modeller v9.2337 para conformaciones IF y OF, respectivamente. De hecho, I-Tasser inicialmente no pudo predecir el dominio L0 consistente para el estado OF bMRP1-(ATP)2 en comparación con el modelo IF. Por lo tanto, en aras de la coherencia, el dominio OF bMRP1-(ATP)2 L0 se creó utilizando el modelador v9.23 basado en la secuencia, pero también en el modelo de dominio IF L0 como plantilla (Tabla complementaria 13). Para garantizar la consistencia entre los modelos de dominio L0, la estructura y la dinámica se monitorearon evaluando RMSF sobre simulaciones MD, pero también comparando las estructuras finales del modelo de dominio L0 que convergieron hacia estructuras secundarias similares (Figs. 38 y 39 complementarias). Asimismo, en los modelos actuales también se agregó el bucle faltante entre TMH6 y NBD1.

Las conformaciones IF se construyeron en diferentes estados unidos, a saber, estados unidos apo, ATP2, LTX y LTX-(ATP)2, mientras que la conformación OF se construyó únicamente en el estado unido a ATP2. IF bMRP1-(ATP)2 e IF bMRP1-LTX-(ATP)2 se construyeron superponiendo por separado NBD de 5UJ9 y 5UJA, respectivamente, sobre los NBD de conformación OF en los que tanto las moléculas de ATP como las de Mg2+ están unidas a los NBS. Todos los modelos finales se minimizaron brevemente en el vacío utilizando el paquete Amber1838,39 para evitar choques estéricos no físicos.

Se utilizó el generador de entrada CHARMM-GUI40,41 para integrar los diferentes modelos de bMRP1 en diferentes bicapas lipídicas, a saber, POPC puro, POPC:Chol (3:1) y POPC:POPE:Chol (2:1:1) aprovechando las coordenadas de bMRP1 obtenido de la base de datos OPM (Orientations of Proteins in Membranes)42. Las estructuras IF apo bMRP1 y OF bMRP1-(ATP)2 también se incrustaron en bicapas lipídicas POPE y POPC:POPE (3:1) puras para investigar específicamente las interacciones lípido-proteína con los lípidos PE. La estructura crio-EM resuelta de OF bMRP1-(ATP)2 también incluye tres moléculas de colesterol resueltas que se mantuvieron durante todas las simulaciones para investigar su importancia. De estas diferentes composiciones de bicapa lipídica, la mezcla POPC: POPE: Chol (2: 1: 1) apareció como la más relevante para modelar las membranas celulares. Se consideraron los otros tipos de membranas para ayudar a comprender el papel de cada lípido en la dinámica de las proteínas. El tamaño total original de cada sistema era ca. 120 × 120 × 180 Å3 (consulte la Tabla complementaria 14 para ver las descripciones del sistema). Para imitar las condiciones fisiológicas, se utilizó NaCl 0,15 M y los sistemas se solvataron utilizando moléculas de agua explícitas TIP3P43,44,45. Los sistemas finales están hechos de ca. 245,000 átomos (ver detalles en la Tabla complementaria 14).

Los resultados de CHARMM-GUI40,41 se convirtieron al formato Amber utilizando scripts de AmberTools38,39 (es decir, charmmlipid2amber.py y pdb4amber). Con respecto a los sistemas unidos a ATP2 y LTX, se agregaron sustrato, nucleótidos e iones Mg2+ después de construir los sistemas proteína-lípido; por lo tanto, se aseguró la neutralidad eliminando aleatoriamente el número correspondiente de contraiones. Amber FF14SB46, Lipid1747 y los campos de fuerza DNA.OL1548,49 modificados se usaron para modelar respectivamente residuos de proteínas, lípidos y moléculas de ATP. Las moléculas de agua, los iones Mg2+ y los contraiones se modelaron utilizando el modelo de agua TIP3P43,44,45, así como los parámetros de iones monovalentes y divalentes correspondientes de Joung y Cheatham50,51. Los parámetros del sustrato LTX (leucotrieno C4) se derivaron del campo de fuerza ámbar generalizado versión 2 (GAFF2)52 usando el software Antechamber53. Las cargas atómicas parciales LTX se derivaron de cálculos basados ​​en la mecánica cuántica en el nivel de teoría HF/6-31G*, utilizando el servidor RED54. Cada sistema se simuló con condiciones de contorno periódicas. El límite para las interacciones no enlazadas fue de 10 Å para los potenciales de Coulomb y van der Waals. Las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon utilizando el método Ewald de malla de partículas55.

La minimización y termalización de los sistemas y las simulaciones MD se realizaron con los paquetes Amber18 y Amber2038,39 utilizando las versiones CPU y GPU PMEMD. La minimización se llevó a cabo en cuatro pasos minimizando secuencialmente: (i) átomos de O en agua (20.000 pasos); (ii) todos los enlaces que involucran átomos de H (20,000 pasos); (iii) moléculas de agua y contraiones (50.000 pasos) y (iv) todo el sistema (50.000 pasos). Luego, cada sistema se termalizó en dos pasos: (i) las moléculas de agua se termalizaron a 100 K durante 50 ps en condiciones de conjunto (N, V, T) utilizando una integración de tiempo de 0,5 fs; (ii) todo el sistema se termalizó luego de 100 K a 310 K durante 500 ps en condiciones de conjunto (N, P, T) con un paso de tiempo de 2 fs en condiciones semiisotrópicas. Luego, cada sistema se equilibró durante 5 ns en condiciones de conjunto (N,P,T) con un paso de tiempo de 2 fs en condiciones semi-isotrópicas, utilizando el barostato de Berendsen. Luego se llevaron a cabo corridas de producción a escala de microsegundos con un paso de tiempo de integración de 2 fs en condiciones de conjunto (N, P, T) con escala semiisotrópica. La temperatura se mantuvo utilizando el termostato dinámico Langevin56 con una frecuencia de colisión de 1,0 ps−1. La presión constante establecida en 1 bar se mantuvo con escala de presión semiisotrópica utilizando el barostato Berendsen57 para IF apo bMRP1 y OF bMRP1-(ATP)2 o el barostato Monte Carlo para IF bMRP1-(ATP)2, IF bMRP1-LTX y IF bMRP1 -LTX-(ATP)2. Este último se utilizó para acelerar el tiempo de cálculo.

Con el fin de garantizar el acoplamiento de ATP en NBS, se llevaron a cabo simulaciones de restricción-MD utilizando un enfoque similar al propuesto por Wen et al.58. En breve, se aplicó un conjunto de restricciones basadas en la distancia entre los residuos de triptófano/tirosina del bucle A (Trp653 y Tyr1301, respectivamente para NBD1 y NBD2) y el resto de purina ATP correspondiente. El arreglo Mg2+-ATP-NBD se mantuvo aplicando restricciones entre los iones Mg2+ y los grupos fosfato de ATP, así como entre los iones Mg2+ y la serina Walker A y el residuo de glutamina Q-loop (a saber, Ser685 y Gln713 para NBD1 y Ser1333, Gln1374 para NBD2). Además, los restos de fosfato de ATP también estaban restringidos con los residuos de Walker A circundantes. Todas las distancias se restringieron utilizando potenciales armónicos para los cuales las distancias mínimas y las constantes de fuerza se informan en las Tablas complementarias 15–16. Se aplicaron restricciones basadas en la distancia para los pasos de termalización y equilibrio de la caja. Luego se eliminaron suavemente a lo largo de los primeros 10 ns de ciclos de producción. Las restricciones para los iones Mg2+ se mantuvieron durante toda la simulación.

Las instantáneas se guardaban cada 100 ps. Para cada sistema, se realizaron tres réplicas para muestrear mejor el espacio conformacional local. Cada ciclo de producción se llevó a cabo durante 2,0–2,5 μs y 1,5–2,0 μs, respectivamente para los modelos IF y OF (Tabla complementaria 17). De hecho, las simulaciones realizadas con el modelo OF alcanzaron el equilibrio más rápido que las conformaciones IF (ver RMSD dependientes del tiempo en la Fig. 40 complementaria). En el presente estudio, el tiempo MD total agregado es 112,4 μs.

Las simulaciones se analizaron utilizando el paquete CPPTRAJ59 y scripts internos de Python aprovechando el módulo MDAnalysis60,61. Los gráficos se obtuvieron utilizando el paquete de Python matplotlib v3.3.162. La visualización y el renderizado de la estructura se prepararon con el software VMD63 (v1.9.3 y alpha-v1.9.4). Los llamados parámetros estructurales ABC (es decir, ángulo IC, ángulo EC, distancia NDB, giro NBD y distancia EC) se calcularon utilizando la misma definición propuesta por Hofmann et al.1 para ángulo IC, ángulo EC, distancia EC y NBD. distancia o Moradi et al.18 para giro NBD. En resumen, el ángulo IC describe la apertura IC de la entrada del sustrato y se define por el ángulo entre dos vectores; ambos comenzando desde el centro de masa de toda la región extracelular y dirigidos hacia la región IC de TMH1, TMH2, TMH3, TMH6, TMH10 y TMH11 o la región IC de TMH4, TMH5, TMH7, TMH8, TMH9 y TMH12. Del mismo modo, el ángulo EC describe la apertura de EC para la liberación del sustrato y se define por el ángulo entre dos vectores que comienzan desde el centro de masa de ambos NBD y se dirigen hacia la región EC de TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 y TMH12 o la región EC de TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 y TMH8. La distancia EC se definió como la distancia entre las regiones EC de TMH1, TMH2, TMH9, TMH10, TMH11 y TMH12 y la región EC de TMH3, TMH4, TMH5, TMH6, TMH7 y TMH8. La distancia NBD se definió como la distancia entre los dos centros de masa NBD. Dado que estas definiciones se aplicaron a los modelos MD actuales de bMRP1 pero también a las estructuras resueltas disponibles de otros transportadores ABC, las regiones intracelulares y extracelulares se definieron en función del grosor de la membrana propuesto en la base de datos OPM42. Las selecciones de residuos para cada sistema y cada parámetro de estructura se informan en la Tabla complementaria 1. Para cada sistema y cada bicapa lipídica, el paisaje de energía libre local se calculó utilizando el enfoque InfleCS que aprovecha los modelos de mezcla gaussiana (GMM)23,64. Se tomaron parámetros estructurales (es decir, ángulos IC y EC, distancia NBD y giro) para monitorear el paisaje de energía libre utilizando un tamaño de cuadrícula establecido en 80, de 2 a 12 componentes gaussianos para cada GMM obtenido por un máximo de 20 iteraciones. La relevancia del enfoque de InfleCS depende en gran medida de la calidad del muestreo durante las simulaciones MD. En el presente trabajo, InfleCS solo representa el paisaje de energía libre alrededor de los mínimos locales muestreados durante nuestras simulaciones MD. Además, el muestreo MD y la relevancia de InfleCS para los sistemas actuales se aseguraron calculando los perfiles de convergencia para cada parámetro estructural por separado (Figs. 41–43 complementarias).

El perfil de poro de agua de la cavidad bMRP1 TM se calculó utilizando el software Hole2.265 tomando instantáneas cada 10 ns. El perfil de poro promedio de TM se calculó promediando la parte equilibrada de las trayectorias considerando todas las réplicas. La evolución de poros TM dependiente del tiempo desde el principio también se calculó a profundidades seleccionadas en la membrana de bicapa lipídica (z = 18, 5, −15 y −22 Å) mediante arranque cada 100 ns a lo largo de las trayectorias MD (es decir, 10 instantáneas × 3 réplicas cada 100 ns). Luego se promediaron los perfiles y se usaron perfiles de densidad z de átomos de PC P para definir el centro de la membrana de bicapa lipídica (z = 0). En cuanto a los ángulos de inclinación, todos los sistemas se alinearon con el modelo OF bMRP-(ATP)2 integrado en POPC:POPE:Chol (2:1:1). Las distribuciones de lípidos se obtuvieron usando el paquete CPPTRAJ59. Se calcularon las ocupaciones de lípidos para cada cabeza polar (es decir, PE o PC) o molécula de colesterol total alrededor de la proteína, considerando ocupaciones umbral al 50 o al 80%. Las densidades de lípidos dependientes de los folletos se calcularon utilizando la palabra clave de cuadrícula en CPPTRAJ centrándose en los lípidos de la cabeza polar (PE o PC) o el grupo OH del colesterol. La atención se centró únicamente en la región de la cabeza polar de alta densidad obtenida mediante el control de los picos de densidad dependientes de z de los átomos de fosfato para los lípidos PC y PE o el átomo O para las moléculas de colesterol. Los espesores de membrana se obtuvieron utilizando el MEMBPLUGIN para VMD63,66. La deformación de energía libre se evaluó calculando el costo de energía libre de la deformación de la membrana en presencia de bMRP1, así como las referencias de energía libre para membranas planas, usando el software CTMDapp30. Todos los parámetros utilizados para estos cálculos se informan en la Tabla complementaria 18. Dado el muestreo actual, el tamaño de la proteína y la relevancia de los módulos de flexión y compresibilidad en las simulaciones actuales de todos los átomos, los resultados que se muestran en la Fig. 4c se discuten cualitativamente.

Los análisis de componentes principales también se realizaron utilizando el paquete CPPTRAJ59, centrándose en el núcleo ABC, definido por los átomos de la columna vertebral de TMH1 a TMH12, NBD1 y NBD2. Las variabilidades del sistema se investigaron mediante la realización de PCA independientes para cada sistema para el cual cada réplica se alineó con una estructura promedio del sistema. Los análisis de red se realizaron utilizando el complemento VMD Network Analysis63,67. Las matrices dinámicas de correlación cruzada (DCCM) se calcularon por separado para cada réplica en la que se seleccionaron átomos de Cα como nodos y se aplicaron todas las restricciones predeterminadas (notSameResidue, notNeighboringCAlpha, notNeighboringPhosphate, notNeighboringResidue). Luego se calcularon las comunidades usando gncommunities67. Las vías de la red de alosteria se determinaron utilizando el enfoque Allopath reciente desarrollado por Westerlund et al.26,27. En breve, la "eficiencia de comunicación" distante entre dos dominios se obtuvo del mapa de contacto y la matriz de información mutua de los residuos de proteínas, así como de los interactuantes no proteicos, como los lípidos circundantes y las moléculas unidas (p. ej., nucleótidos y sustrato). Tal enfoque también proporciona un perfil de intermediación que ilustra la participación de cada componente (es decir, residuo, lípido, sustrato y nucleótido). Para cada molécula de lípido, se definieron tres nodos correspondientes al grupo de cabeza polar y las dos colas de lípidos (Fig. 44 complementaria). El ATP también se dividió en tres nodos: fracción de purina y ribosa, así como cola de trifosfato. El sustrato LTX se dividió en tres nodos: resto de glutatión, cola poliinsaturada y ácido hidroxipentanoico. Los iones Mg2+ y las moléculas de colesterol se consideraron como un nodo cada uno. Las selecciones de átomos por nodo se informan en la Fig. 44 complementaria. Las vías alostéricas se calcularon desde el bolsillo de unión del sustrato a cada NBS, por separado, como se define en la Tabla 9 complementaria. Los análisis de enlaces H (Figs. 45 y 46 complementarias) se realizaron utilizando CPPTRAJ59 en el que los cortes de distancia y ángulo se establecieron en 3,5 Å y 120 °, respectivamente. Los DCCM calculados utilizando CPPTRAJ también están disponibles en las Figs. complementarias. 47–50. Las descripciones estructurales de los mínimos locales se realizaron solo en la parte equilibrada de las simulaciones MD, es decir, considerando los últimos 800 ns como se muestra en los perfiles RMSD informados en la Fig. 41 complementaria.

Para todos los análisis MD descritos en este documento, los datos se derivaron de n = 3 simulaciones MD para cada estado (es decir, IF apo bMRP1, bMRP1-LTX, bMRP1-(ATP)2, bMRP1-LTX-(ATP)2 y OF bMRP1 -(ATP)2) y membranas de bicapa lipídica (es decir, POPC pura, POPC:Chol (3:1) y POPC:POPE:Chol (2:1:1) para todos los estados pero también POPE pura y POPC:POPE ( 3:1) para IF apo bMRP1 y OF bMRP1-(ATP)2). En otras palabras, se consideraron 19 sistemas, para 57 simulaciones. Los análisis se realizaron sistemáticamente considerando cada sistema independiente. Los promedios y las desviaciones estándar generalmente se obtuvieron extrayendo datos de cada réplica en conjunto para mostrar la variabilidad conformacional del muestreo. Para los análisis de enlace H, la deformación de energía libre y las comunicaciones alostéricas, los resultados se calcularon para cada réplica por separado y se obtuvieron errores y desviaciones promedio y estándar sobre las tres réplicas tratadas de forma independiente.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados a partir de las simulaciones MD realizadas en este trabajo están disponibles de los autores a pedido razonable. Los datos de origen subyacentes a los resultados y la gráfica presentados en las figuras principales, las entradas de MD, así como las configuraciones de coordenadas iniciales y finales para cada estado y modelo de lípidos, y las películas complementarias 1 a 5 se pueden descargar en el siguiente enlace de acceso de Zenodo: https://doi .org/10.5281/zenodo.7541178.

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Descargar referencias

Los autores agradecen al Dr. Benjamin Chantemargue y al Dr. Mehdi Benmameri por sus debates científicos estimulantes y fructíferos. Agradecemos a Xavier Montagutelli del departamento de TI de la Universidad de Limoges por el soporte técnico con respecto a las instalaciones de supercomputadoras. Los cálculos se realizaron utilizando las supercomputadoras CALI ("CAlcul en LImousin") y "Baba Yaga" alojadas en la Universidad de Limoges, así como en la supercomputadora nacional "Jean-Zay" de recursos IDRIS HPC, bajo las asignaciones 2020-A0080711487 y 2021-A0100711487 hecho por GENCI. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la "Agence Nationale de la Recherche" (ANR-19-CE17-0020-01 IMOTEP y ANR-21-CE18-0030 RAPRACLID), Région Nouvelle Aquitaine y "Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale" (INSERM, AAP-NA-2019-VICTOR).

Inserm U1248 Farmacología y trasplante, ΩHealth Institute—Univ. Limoges, 2 rue du Prof. Descottes, 87000 F, Limoges, Francia

Ágota Tóth, Angelika Janaszkiewicz, Veronica Crespi y Florent Di Meo

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EN. y FDM concibió el estudio. EN. y FDM realizaron todas las simulaciones. Á.T., AJ, VC y FDM analizaron las simulaciones. EN. y FDM interpretaron los resultados y los discutieron junto con AJ y VC Á.T. y FDM escribieron el manuscrito y fue editado, revisado y aprobado por todos los autores.

Correspondencia a Florent Di Meo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Mahmoud Moradi y Shuguang Yuan por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Yun Lyna Luo y Gene Chong. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Tóth, Á., Janaszkiewicz, A., Crespi, V. et al. Sobre la interacción entre los lípidos y la dinámica asimétrica de un transportador ABC degenerado de NBS. Comun Biol 6, 149 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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Recibido: 20 mayo 2022

Aceptado: 25 de enero de 2023

Publicado: 03 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04537-3

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