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Aug 05, 2023

vaccinia

Volumen de comunicaciones de la naturaleza

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1770 (2023) Citar este artículo

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La evolución dirigida en sistemas de visualización de bacterias o levaduras se ha utilizado con éxito para mejorar la estabilidad y la expresión de receptores acoplados a proteínas G para estudios estructurales y biofísicos. Sin embargo, varios receptores no pueden abordarse en los sistemas microbianos debido a su composición molecular compleja o a sus propiedades ligando desfavorables. Aquí, informamos un enfoque para desarrollar receptores acoplados a proteínas G en células de mamíferos. Para lograr clonalidad y expresión uniforme, desarrollamos un sistema de transducción viral basado en el virus Vaccinia. Mediante el diseño racional de bibliotecas de ADN sintético, primero desarrollamos el receptor de neurotensina 1 para una alta estabilidad y expresión. En segundo lugar, demostramos que los receptores con arquitecturas moleculares complejas y grandes ligandos, como el receptor de la hormona paratiroidea 1, pueden evolucionar fácilmente. Es importante destacar que las propiedades funcionales del receptor ahora pueden evolucionar en presencia del entorno de señalización de los mamíferos, lo que da como resultado variantes del receptor que exhiben un mayor acoplamiento alostérico entre el sitio de unión del ligando y la interfaz de la proteína G. Por lo tanto, nuestro enfoque proporciona información sobre la intrincada interacción molecular requerida para la activación de GPCR.

Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) comprenden la familia más grande de proteínas integrales de membrana y están involucrados en la regulación de muchos procesos biológicos1. Los GPCR detectan una gran variedad de ligandos, desde moléculas pequeñas hasta proteínas grandes, en su lado extracelular. Para ejercer su función, los GPCR muestrean un continuo de estados conformacionales, lo que da como resultado niveles de actividad nula a actividad máxima. Los ligandos estabilizan distintas conformaciones que mantienen al receptor en un estado inactivo (en el caso de los agonistas inversos) o activo (en el caso de los agonistas)2. El cambio conformacional inducido por un agonista en el bolsillo de unión del ligando se transmite a la superficie intracelular del receptor y da como resultado la activación de proteínas G heterotriméricas mediante el intercambio de GDP por GTP en la subunidad Gα. Como consecuencia, las subunidades Gα y Gβγ se disocian y pueden activar procesos de señalización aguas abajo3,4. Dada su amplia relevancia fisiológica, los GPCR son importantes dianas farmacológicas1, y la comprensión de los mecanismos estructura-función que conducen a la activación de GPCR es fundamental para el futuro desarrollo de fármacos. Si bien la flexibilidad conformacional es esencial para la función adecuada del receptor, es un obstáculo para determinar experimentalmente las estructuras de las proteínas. Esta ha sido la motivación de importantes esfuerzos de ingeniería para hacer que los GPCR sean aptos para estudios estructurales.

Previamente, hemos ideado varias estrategias utilizando la evolución dirigida para mejorar las propiedades biofísicas de los GPCR5,6,7,8. La evolución dirigida tiene como objetivo acelerar el proceso de evolución natural, es decir, el enriquecimiento de rasgos deseables que están codificados en un grupo de variantes genéticas, por medio de rondas iterativas de diversificación y selección de genes. Por lo tanto, la función de la proteína se puede alterar o crear de novo y, por lo tanto, la evolución dirigida se ha convertido en un método poderoso para desarrollar nuevas herramientas y terapias moleculares, aunque se aplica principalmente a proteínas solubles. Para extender esta metodología a los GPCR, se utilizaron organismos microbianos como bacterias y levaduras. Por transformación con plásmidos, pueden tomar, en promedio, una copia, de modo que después de que el plásmido establece su número de copias, cada célula microbiana sigue siendo "clonal". Se ha demostrado la expresión de GPCRs en forma funcional en la membrana plasmática de la levadura o en la membrana interna de E. coli5,8,9 y, por lo tanto, se garantiza un acoplamiento estricto de fenotipo y genotipo, que es un requisito clave para la evolución dirigida. Además, se pueden lograr altas tasas de transformación en microbios para representar eficientemente diversas bibliotecas de genes. Utilizando la selección impulsada por la cantidad de receptores de unión a ligandos y, por lo tanto, funcionales en la membrana, se generó una variedad de variantes de GPCR estables y de buena expresión que fueron fundamentales para estudios estructurales y proyectos de descubrimiento de fármacos10,11,12,13,14,15, 16,17.

Si bien la eficiencia de manejo y la generación de bibliotecas en bacterias y levaduras son adecuadas, existen algunas limitaciones fundamentales que acompañan a los sistemas de expresión microbiana con respecto a su aplicabilidad para las proteínas de membrana. La membrana plasmática de los microbios está típicamente protegida por una membrana externa o pared celular, de modo que el sitio de unión del ligando de los receptores no es fácilmente accesible desde el lado extracelular, especialmente para los ligandos más grandes. Se han diseñado protocolos de permeabilización eficientes para hacer que estas barreras externas sean permeables para moléculas pequeñas y ligandos peptídicos cortos5,6,8, pero es posible que las moléculas más voluminosas, como las hormonas peptídicas o las proteínas, no alcancen fácilmente su sitio de unión en el receptor. Además, muchos GPCR son altamente tóxicos para las bacterias y las células de levadura, lo que limita el número de objetivos potenciales que se desarrollarán, ya que se requiere un mínimo de expresión basal para la selección. Finalmente, la función del receptor, es decir, el potencial para enviar señales a los efectores aguas abajo, no puede abordarse fácilmente en los sistemas microbianos porque las cascadas de señalización endógenas faltan por completo (en el caso de las bacterias) o solo están presentes con una funcionalidad muy reducida (en el caso de la levadura). ). Por lo tanto, la evolución de GPCR en sistemas microbianos hasta ahora se ha restringido a mejorar la expresión y la estabilidad del receptor, sin abrir aún la posibilidad de aplicar el potencial de la evolución dirigida para explorar aspectos funcionales de la señalización de GPCR.

Por el contrario, en las células de mamíferos no existen tales limitaciones y, por lo tanto, los sistemas de visualización de mamíferos pueden abrir nuevas posibilidades para las combinaciones de ligando-receptor. Sin embargo, trasladar la facilidad de crear grandes bibliotecas desde un sistema de visualización microbiano a células de mamíferos ha sido un desafío. Muchos intentos de crear bibliotecas de mamíferos se han basado en vectores lentivirales con bajas multiplicidades de infección18. Se derivan del genoma del VIH y su genoma se inserta en el genoma del huésped. Si bien esto crearía bibliotecas estables, existen desventajas considerables en este enfoque: la diversidad máxima de la biblioteca es limitada, el punto de inserción determina el nivel de expresión al menos tanto como el fenotipo del mutante, el nivel de expresión será tan bajo como el número de copias del gen es muy bajo, y la identificación de proteínas mutantes es bastante tediosa, ya que el ADN solo se puede obtener a partir de PCR de una sola célula. Además, los transgenes insertados pueden silenciarse de una manera bastante impredecible. Los enfoques recientes utilizan tecnología CRISPR/CAS o sistemas de integrasa dedicados que son independientes de los vectores virales; sin embargo, en la actualidad, el tamaño de la biblioteca es limitado19,20,21. Otros métodos se basan en la evolución dirigida continua, en la que se utiliza un vector viral de baja fidelidad que crea una mutagénesis permanente durante la replicación viral. Si bien esto supera el desafío de crear diversas bibliotecas virales recombinantes, estos sistemas son difíciles de controlar y requieren regímenes de selección eficientes22,23.

Aquí, presentamos un sistema de selección de mamíferos para la evolución dirigida de GPCR, que se basa en un vector Vaccinia. Permite la generación sencilla de bibliotecas muy diversas que dan como resultado una expresión homogénea de GPCR, esencial para la posterior selección guiada por expresión. Empleamos este sistema para evolucionar GPCR de clase A y B y demostramos que, en combinación con un diseño de biblioteca racional, se puede usar para manipulaciones extensas de propiedades de GPCR, que van desde la generación de variantes de receptor altamente estabilizadas hasta la modulación de las propiedades de señalización del receptor.

La expresión monoclonal y homogénea del gen de interés son requisitos previos críticos para las selecciones en evolución dirigida que son difíciles de lograr en células de mamíferos con estrategias de expresión comunes, como la transfección transitoria. Para alcanzar la misma dosis de genes y clonalidad, la célula necesita tomar una sola molécula de vector y replicarla en un número de copias que sea similar en todas las células. Por lo tanto, empleamos un sistema de vectores que habíamos ideado recientemente para generar diversas bibliotecas de ADNc en el virus Vaccinia24,25. El virus vaccinia tiene un genoma de ADN lineal de aproximadamente 180 kDa que se replica y empaqueta en el citoplasma. Por lo tanto, la expresión génica del vector es homogénea entre las células, y los recombinantes específicos pueden recuperarse fácilmente incluso a partir de cantidades muy pequeñas de células seleccionadas.

Para probar si se puede lograr una expresión uniforme de GPCR con el vector Vaccinia, evaluamos la expresión de varias variantes del receptor de neurotensina 1 (NTR1). Se infectaron células A-431 con virus recombinante a una MOI de 1 ufp por célula, asegurando así una distribución media de una partícula viral por célula. 16–18 h después de la infección, se recolectaron las células y se analizó la expresión del receptor mediante citometría de flujo utilizando el ligando NT (8–13) marcado con fluorescencia y se comparó con las células CHO que se habían transfectado transitoriamente con las mismas construcciones de receptor. Las células infectadas con vaccinia exhibieron niveles de expresión homogéneos con distribución estrecha (Fig. 1a). Por lo tanto, fue posible una clara discriminación en la expresión del receptor entre NTR1 de tipo salvaje y NTR1-TM86V y NTR1-L5X, dos variantes que se habían desarrollado previamente para aumentar la expresión funcional en E. coli26. Por el contrario, la expresión de las variantes del receptor en células transfectadas transitoriamente dio como resultado una amplia distribución de los niveles de expresión para cada construcción, lo que refleja las cantidades variables de plásmido que habían absorbido las células (Fig. 1a). Por lo tanto, el sistema de expresión basado en Vaccinia permite la expresión homogénea de GPCR en células de mamíferos y permite una discriminación clara entre variantes con distintos niveles de expresión. Para crear bibliotecas de ADNc grandes y diversas, que son necesarias para la evolución dirigida, se ha desarrollado una estrategia de recombinación específica que denominamos Recombinación Trimolecular24. Aquí, un genoma dividido de Vaccinia se complementa con un tercer fragmento que lleva el gen de interés junto con un marcador de selección. Solo tras la recombinación de los tres fragmentos se forman partículas virales productivas. Como resultado, el fondo de virus no recombinantes es cercano a cero, lo que permite la construcción de bibliotecas que contienen millones de vacunas recombinantes diferentes24. Con base en estos resultados, ideamos una plataforma de selección para la evolución dirigida de GPCR en células de mamíferos que se inspira en la evolución guiada por expresión en células bacterianas y de levadura5,8 (Fig. 1b).

a Comparación de la expresión de GPCR en células de mamífero transfectadas con plásmido y transducidas con Vaccinia. Células CHO transfectadas transitoriamente (panel superior derecho), células A431 infectadas con construcciones del virus Vaccinia (panel inferior derecho). Se muestran el control negativo (sombreado en gris), NTR1 (línea negra), NTR1-TM86V (línea roja) y NTR1-L5X (línea azul). b Flujo de trabajo para la evolución dirigida en células de mamífero utilizando el virus Vaccinia. Después de la síntesis de la biblioteca de ADN de GPCR, se crea una biblioteca de virus Vaccinia mediante Trimolecular Recombination24 (recuadro izquierdo; amarillo, regiones homólogas al virus para la recombinación; azul, gen de interés). Para este propósito, la biblioteca de ADN de GPCR aleatoria se clona primero en un plásmido de transferencia de virus Vaccinia. Luego, el gen GPCR se recombina con el ADN del virus Vaccinia digerido y las partículas virales infecciosas se empaquetan utilizando un virus auxiliar de la viruela aviar. La biblioteca de virus se utiliza para infectar células A-431 durante la noche con una multiplicidad de infección de un virus por célula, cubriendo la diversidad de la biblioteca con una redundancia de 5 a 10. Dado que la membrana plasmática de las células de mamífero es fácilmente accesible desde el espacio extracelular (ECS), los receptores expresados ​​pueden marcarse directamente con un ligando fluorescente de elección. Las células que tienen una mayor densidad de receptores exhibirán una mayor unión de ligandos y, por lo tanto, una mayor fluorescencia, que luego se clasifican mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Después de la clasificación, las células se lisan mecánicamente para liberar el virus, que luego se amplifica en células alimentadoras frescas. El conjunto de virus ordenados se puede utilizar para infectar en rondas de selección posteriores.

En primer lugar, nuestro objetivo era comparar las capacidades del sistema de los mamíferos con selecciones de enfoques de evolución dirigida anteriores en células microbianas. Por lo tanto, elegimos NTR1, ya que nuestro trabajo anterior ha investigado este receptor en cuatro sistemas de selección microbianos diferentes, que han mostrado una selección exitosa tanto para una mayor estabilidad como para una mayor expresión funcional de GPCR5,6,7,8. En lugar de crear una biblioteca completamente aleatoria mediante una PCR propensa a errores, se adoptó un enfoque semirracional para generar una biblioteca sintética en la que la posición y el tipo de mutación pudieran controlarse fácilmente. Con base en la estructura cristalina de NTR1 (ID de PDB: 4BUO)10, se eligieron residuos para la aleatorización que probablemente estaban involucrados en los contactos hélice-hélice, mientras que los residuos que se enfrentaban al entorno de la membrana lipídica o que potencialmente estaban involucrados en la interacción ligando o proteína G fueron excluidos . En total, se seleccionaron 94 residuos para la aleatorización. La mutagénesis se restringió a un conjunto predefinido de sustituyentes para cada posición, que se había derivado de una matriz de sustitución filogenética que incluía los aminoácidos más predominantes para cada posición de los GPCR de clase A (Fig. 1 complementaria, cf Notas complementarias). Para hacer que el resultado de la selección sea comparable con campañas anteriores realizadas en sistemas de visualización microbianos, decidimos desacoplar el receptor de sus proteínas G afines ab initio, evitando así cualquier posible influencia de la interacción receptor-proteína G, que es posible en células de mamífero pero no en células microbianas, en el resultado de la selección. Para este fin, R1673.50 se mutó a Leu en toda la biblioteca, que por lo demás se basaba en rNTR1 de tipo salvaje. L1673.50 interrumpe el motivo D/ERY conservado que se requiere para el acoplamiento de la proteína G y, por lo tanto, fija el receptor en un estado inactivo14,27,28,29 (Fig. 1 complementaria).

La biblioteca de ADNc resultante contenía un promedio de 2,9 % de mutaciones para cada posición aleatoria, lo que resultó en un promedio de 2,8 mutaciones por gen (Fig. 1d, e complementarias). A partir de esta biblioteca sintética, se creó una biblioteca viral mediante recombinación trimolecular que produjo una diversidad de 1,3 × 108, y las células A-431 se infectaron con un MOI de 1. Como en la evolución anterior del receptor microbiano, las selecciones se realizaron en función del nivel de expresión funcional. Para este propósito, las células que expresan el receptor se incubaron con concentraciones saturadas de NT(8-13) marcadas con fluorescencia y se sometieron a FACS mediante el cual se enriquecieron las células con los niveles más altos de fluorescencia (es decir, la expresión más alta del receptor). Después de cada ronda de clasificación, el virus se aisló directamente de los grupos de células enriquecidas, se amplificó y se usó para infectar un lote nuevo de células para la siguiente ronda de selección (Fig. 1b). En total, se realizaron dos rondas de selección seleccionando el 0,5 % y el 0,06 % superiores de células fluorescentes, respectivamente. Después de cada ronda de selección, se observó un desplazamiento hacia la derecha en la señal de fluorescencia de la población clasificada, lo que indica un mayor nivel de expresión del receptor en el grupo seleccionado (Fig. 2a). De cada grupo de selección, el ADNc de NTR1 se amplificó mediante PCR y se subclonó en un vector de expresión de mamífero y se secuenció. Se aislaron 94 clones y se analizaron los niveles de expresión del receptor, y los 25 clones que expresaban mejor se analizaron adicionalmente. En general, los niveles de expresión fueron entre 25 y 82 veces mayores que los de NTR1 de tipo salvaje y, por lo tanto, similares o incluso superiores a los niveles que alcanzaron los mutantes evolucionados de E. coli26. En contraste, el mutante subyacente NTR1-R167L solo mostró una ganancia de expresión de 2.5 veces en comparación con NTR1 de tipo salvaje, lo que indica que la presión de selección fue exitosa y la mayor parte del aumento de expresión se acumuló durante las selecciones (Fig. 2b, Tabla complementaria 1) .

a Puertas de clasificación para variantes NTR1 mejoradas (panel izquierdo). La puerta de clasificación para las células fluorescentes superiores al 0,5 % se indica con un contorno rojo. Histograma que compara las poblaciones de primera y segunda orden después de la amplificación en comparación con las de tipo salvaje (panel derecho): orden 1 (línea roja), orden 2 (línea azul), NTR1 (línea negra), control negativo (sombreado en gris oscuro). b Análisis de expresión de 25 variantes de NTR1 evolucionadas. La expresión del receptor se evaluó en células HEK293T mediante análisis de citometría de flujo con concentraciones de saturación de HL488-NT(8–13). Los niveles de expresión son relativos a la expresión del receptor de tipo salvaje y se dan como valores medios ± sem de 2 experimentos independientes. c Afinidades de ligando de 25 variantes evolucionadas de NTR1. Los valores de IC50 se derivaron de experimentos de unión a competición de ligandos de células enteras con NT(8–13). Las barras representan el cambio medio ± sem en la afinidad calculada (∆pIC50) para cada mutante, en comparación con el receptor de tipo salvaje de 3 experimentos independientes, cada uno realizado en duplicados técnicos (Tabla complementaria 1). d Correlación entre la expresión del receptor y la termoestabilidad. La termoestabilidad de siete variantes de NTR1 se evaluó en fracciones de membrana celular y se representa gráficamente como el cambio en la temperatura de fusión (∆Tm), medido por la unión del ligando, del receptor de tipo salvaje frente a los niveles de expresión de (b). Los datos representan valores medios ± sem de 2 a 3 experimentos independientes realizados por duplicado (Tabla complementaria 1). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Al igual que para el mutante R1673.50L, la señalización de todas las variantes de NTR1 evolucionadas, todas las que contenían esta mutación, se vio fuertemente afectada, alcanzando solo el 35 % de la eficacia del NTR1 de tipo salvaje con los mejores mutantes (Figura 2 complementaria, Tabla 1 complementaria) . Por lo tanto, la mutación R1673.50L común tuvo un fuerte impacto en la función del receptor que la evolución no pudo superar. La mutación R1673.50L sola aumentó la afinidad por NT (8-13) ~ 3 veces, mientras que las variantes del receptor evolucionado exhibieron una afinidad por el agonista hasta 30 veces mayor (Fig. 2c, Tabla complementaria 1). Esta aparente discrepancia de lograr una mayor afinidad en ausencia de mutaciones directas en el sitio de unión ortostérico y en ausencia de acoplamiento de proteína G se ha observado para varias otras variantes de NTR1 evolucionadas en E. coli y algunos receptores mutantes estabilizados también por otros medios10 ,14,26,30. Es probable que sea el resultado de la interrupción del acoplamiento alostérico entre el sitio de unión del agonista y la interfaz de la proteína G intracelular a través de la interrupción del microinterruptor DRY y una estabilización del receptor en una conformación inactiva, a pesar de exhibir una unión de alta afinidad27,31. Esto se corroboró aún más al analizar la termoestabilidad de varios clones. Las siete variantes probadas se estabilizaron fuertemente y sus temperaturas de fusión oscilaron entre 4 y 10 °C por encima de NTR1 de tipo salvaje, mientras que la mutación R1673.50L sola no tuvo efecto sobre la termoestabilidad (Tabla complementaria 2). Al igual que en campañas de evolución anteriores realizadas en E. coli26, también aquí se observó una fuerte correlación positiva entre los niveles de expresión y la termoestabilidad (Fig. 2d). El análisis de secuencia reveló entre 5 y 8 mutaciones por variante. Tres puntos críticos de mutación, A1553.38T, Q2395.36T y N3657.49K, estaban presentes en el 56 %, 96 % y 80 % de los clones, respectivamente, lo que sugiere una fuerte presión de selección en cada uno de estos residuos (Fig. 3 complementaria ). A1553.38T y Q2395.36T no se conservan en los GPCR de clase A y no se puede establecer una correlación clara con el aumento de la termoestabilidad. El N3657.49 altamente conservado es parte del microinterruptor NPxxY y está acoplado al sitio de sodio alostérico constituido por D2.50 en los GPCR de clase A, que son mediadores importantes para la propagación de la señal. Se ha demostrado que la mutación de D2.50 estabiliza eficazmente diferentes GPCR de clase A8,32, pero no se encontró tal mutación en nuestra selección. Por lo tanto, será interesante ver si la mutación N3657.49K tiene efectos estructurales y estabilizadores similares a los de la interrupción del sitio de sodio.

Colectivamente, estos datos demuestran que en células de mamífero se pueden obtener variantes de receptor altamente estabilizadas y que expresan bien en solo dos rondas de selección que son comparables a las variantes de mejor expresión que se obtuvieron por evolución bacteriana. De manera similar a las variantes obtenidas de selecciones bacterianas donde el acoplamiento de la proteína G no es posible, los receptores evolucionados que retienen la mutación R1673.50L se vieron fuertemente afectados en la señalización de la proteína G. Esto sugiere que los receptores desarrollados se estabilizaron predominantemente en conformaciones inactivas, pero aún son capaces de lograr la unión de agonistas de alta afinidad, lo que explica las propiedades biofísicas mejoradas. Sin embargo, no fue evidente ninguna similitud de secuencia entre las variantes de NTR1 desarrolladas en células de mamífero y las variantes NTR1-TM86V y NTR1-L5X desarrolladas por E. coli. Por lo tanto, se pueden obtener propiedades biofísicas similares a través de la selección de distintos cambios estructurales.

Los GPCR han evolucionado para detectar una plétora de estímulos distintos en su lado extracelular, lo que se refleja en una gran variabilidad estructural de las regiones receptoras extracelulares. Algunos GPCR contienen dominios extracelulares (ECD), que a menudo exhiben pliegues complejos que requieren los intrincados mecanismos de control de calidad de la célula de mamífero para el plegamiento y la translocación adecuados a la superficie celular. Habiendo demostrado que con nuestro sistema, la estabilización del receptor y la optimización de la expresión se pueden lograr en grados similares o superiores a los resultados de los sistemas microbianos, nos interesaba saber si también los receptores con arquitecturas más complejas serían susceptibles de selección en el sistema de los mamíferos. Para abordar esta pregunta, elegimos el receptor de la hormona paratiroidea 1 (PTH1R), que pertenece a la clase B de GPCR.

Los receptores de esta clase difieren estructuralmente de los GPCR de clase A por un gran dominio extracelular adicional que se requiere para unir ligandos peptídicos. Además, varias modificaciones postraduccionales del ECD agregan una complejidad estructural significativa al pliegue del receptor11,33,34,35, lo que dificulta la expresión en los microbios. Previamente, logramos desarrollar el TMD de PTH1R en levadura para una mayor expresión y estabilidad con un ligando de péptido pequeño diseñado, que era un requisito previo para resolver la estructura cristalina del receptor de longitud completa11. Sin embargo, los intentos de evolucionar directamente el PTH1R de longitud completa utilizando el ligando peptídico nativo de 34 aa habían fallado, debido a la acumulación tóxica del receptor mal plegado y debido al gran tamaño del ligando, incapaz de alcanzar el sitio de unión del ligando en las células de levadura a pesar de permeabilizando la pared celular, demostrando las limitaciones de los sistemas de selección microbiana.

Para realizar la evolución de PTH1R en el sistema de los mamíferos, se creó una biblioteca sintética, siguiendo un enfoque semirracional similar a la biblioteca para NTR1 descrita anteriormente. La aleatorización se restringió al PTH1R TMD, evitando así cambios en el ECD que potencialmente afectarían la unión del ligando. Como este trabajo se había realizado antes de la determinación de la estructura de PTH1R11, el diseño de la biblioteca se basó en un modelo de homología estructural del receptor de glucagón humano. Por lo tanto, se seleccionaron 118 posiciones dentro del TMD para la aleatorización, y aquí los sustituyentes de aminoácidos se eligieron en función de la similitud química. Sin embargo, a diferencia de la biblioteca NTR1, no se introdujeron mutaciones fijas que alterarían la función del receptor, ya que estábamos interesados ​​​​en investigar si las propiedades del receptor más allá de la expresión y la estabilidad también podrían evolucionar en células de mamíferos (Fig. 4 complementaria, cf Notas complementarias) . Sin embargo, se agregaron varias modificaciones a la biblioteca para poder rastrear los resultados de la selección. Incluimos 19 posiciones que habían sido identificadas en la campaña de evolución de la levadura, de las cuales 7 mutaciones específicas mantuvieron al receptor en una conformación inactiva altamente termoestable11. A diferencia de la mutación R1673.50L fija en la biblioteca NTR1, cada una de las posiciones derivadas de levadura se aleatorizó por completo, lo que permitió la selección de residuos de tipo salvaje o alternativos en dicha posición durante la evolución. Además, C351, que forma un enlace disulfuro entre ECL (bucle extracelular) 2 y la parte superior de la hélice transmembrana 311, se aleatorizó para probar si la interrupción de los residuos estructuralmente relevantes corrompería las selecciones (Fig. 4C complementaria).

La biblioteca de ADNc resultante contenía un promedio de 5,6 % de mutaciones para cada posición aleatoria, lo que resultó en ~7 mutaciones por gen (Fig. 4E-F complementaria). A partir de esta biblioteca sintética, se generó una biblioteca viral con una diversidad de 1,1 × 108, y se infectaron células A-431 con la biblioteca a una MOI de 1. Para las selecciones posteriores, se usaron dos ligandos peptídicos marcados con fluorescencia: primero, el péptido corto M-PTH(1–14) que había sido diseñado para unirse solo al TMD de PTH1R, mientras conservaba toda la potencia agonista del péptido nativo36, y segundo, el análogo de PTH PTH'(1–34) que se asemeja a el agonista peptídico nativo, ya que requiere interacciones tanto con el ECD como con el TMD del receptor para una unión de alta afinidad11,37,38. En total, se realizaron tres rondas de selección con cada uno de los ligandos marcados con fluorescencia, clasificando las células fluorescentes superiores del 0, 2 al 0, 5% (Fig. 4G complementaria). También aquí, se observó una mayor fluorescencia celular con rondas de selección crecientes, aunque solo se pudo mantener una pequeña población de células altamente fluorescentes (Fig. 3a). Después de la última ronda, se seleccionaron 92 clones de cada selección de ligando para expresión, y las 43 variantes de expresión superior de ambos grupos se analizaron más. Al igual que para las variantes evolucionadas de NTR1, se observó un aumento en la expresión para todas las variantes de PTH1R, aunque en menor medida (hasta 9 veces para PTH1R frente a hasta 85 veces para NTR1) sobre el tipo salvaje (Fig. 3b, Suplementario Tabla 3). Sin embargo, todas las variantes de PTH1R permanecieron activas en la señalización, con ~ 50% de las variantes que excedieron los niveles máximos de cAMP alcanzados por la activación de PTH1R de tipo salvaje (Fig. 3c, Tabla complementaria 4). Esto contrasta con la evolución previa de PTH1R en levadura, donde se obtuvieron variantes altamente estables pero inactivas en señalización11. El análisis de secuencia de las variantes evolucionadas de PTH1R reveló un conjunto bastante diverso de mutaciones (Fig. 5 complementaria). En contraste con NTR1, no se encontraron mutaciones altamente conservadas y no se alteraron motivos conservados de GPCR de clase B. Sin embargo, se encontró que L3685.44, que interactúa con Val2PTH/PTHrP conservada y M4256.57 y T4276.59 que interactúan con el residuo N-terminal de los péptidos de PTH en estado activo PTH1R38,39,40, estaba mutado en más de 25% de las variantes seleccionadas. Por lo tanto, estas mutaciones podrían proporcionar una justificación mecánica para el aumento observado en la potencia del receptor y requieren más análisis.

a Comparación de las poblaciones después de la selección con PTH'(1–34)-HL647 (panel izquierdo) o M-PTH(1–14)-HL647 (panel derecho) con PTH1R de tipo salvaje: ordenar 1 (línea roja), ordenar 2 (línea azul), clasificación 3a (línea negra), clasificación 3b (línea verde, repetición de 3a), control negativo (sombreado en gris oscuro). b Análisis de expresión de 43 variantes evolucionadas de PTH1R evaluadas en células HEK293T vivas mediante análisis de citometría de flujo con concentraciones de saturación de PTH'(1–34)-HL647. Los niveles de expresión son relativos a la expresión del receptor de tipo salvaje y se dan como valores medios ± sem de 2–3 experimentos independientes (Tabla complementaria 3). c Acumulación de AMPc de 43 variantes de PTH1R evolucionadas después de la estimulación con PTH(1–34) 1 µM. Los datos representan concentraciones máximas de AMPc en relación con PTH1R. Las barras representan valores medios ± sem de 3 a 6 experimentos independientes realizados por duplicado (Tabla complementaria 4). d Afinidades de ligando de 43 variantes evolucionadas de PTH1R en comparación con PTH1R. Los valores de IC50 se derivaron de experimentos de unión a competición de ligandos de células enteras con M-PTH(1–14) o PTH(1–34). Las barras representan el cambio medio ± sem en la afinidad calculada (∆pIC50) para cada mutante en comparación con el receptor de tipo salvaje de 2 a 8 experimentos independientes realizados por duplicado (Tabla complementaria 3). Los ligandos b–d utilizados para la selección se indican debajo de los gráficos de barras. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como habíamos permitido las mismas mutaciones en la biblioteca actual que en la biblioteca de levadura, fue interesante observar que aquellas mutaciones que contribuyeron a la estabilización del receptor pero al mismo tiempo interrumpieron la señalización del receptor, fueron deseleccionadas en el sistema de los mamíferos, y que en casi en todas las posiciones se prefirió la variante de tipo salvaje (Fig. 6 complementaria). Por lo tanto, las mutaciones que habían sido críticas para el éxito de la estabilización de una conformación de receptor inactivo en células de levadura no se preferían en un entorno competente en señalización. Del mismo modo, las mutaciones de C351 se rechazaron por completo, lo que indica que la formación del disulfuro entre ECL 2 y la hélice 3 es un rasgo importante durante la selección (Fig. 6 complementaria), lo que está en línea con su relevancia conocida en la función del receptor33. Además, con respecto a la afinidad del ligando, se observaron claras diferencias con las variantes de NTR1 previamente desarrolladas. La afinidad de unión de PTH(1–34) permaneció mayormente inalterada o solo aumentó modestamente (0,6–5 veces) para las variantes de PTH1R. Sin embargo, la mayoría de las variantes del receptor exhibieron una afinidad fuertemente aumentada por M-PTH(1–14), lo que indica una diferencia fundamental en la unión de ambos ligandos, donde la PTH(1–34) puede depender de su unión al ECD (Fig. 3d, Tabla complementaria 3). Sin embargo, estas diferencias no parecen estar inducidas por el tipo de ligando durante la selección ya que no se detectaron diferencias con respecto a las propiedades aparentes del receptor entre las variantes de cualquier régimen de selección. En conjunto, en células de mamíferos fue posible desarrollar PTH1R de longitud completa con un conjunto de dos ligandos que diferían en tamaño, lo que no había sido posible en sistemas microbianos debido a las limitaciones impuestas por el huésped de expresión. Además, se obtuvieron variantes de receptores que seguían siendo competentes en señalización, lo que demuestra la importancia del contexto celular para el resultado de la selección.

Para NTR1, el desacoplamiento de la transmisión alostérica desde el bolsillo de unión a la interfaz de la proteína G probablemente permite la acumulación de una mayor afinidad por el agonista, lo que dirige al receptor a una conformación inactiva pero estable que se une al agonista. Este no fue el caso para PTH1R evolucionado. Cuando evaluamos la termoestabilidad de cinco variantes de receptor evolucionadas en fracciones de membrana aisladas, todas las variantes probadas exhibieron una termoestabilidad disminuida en comparación con el PTH1R de tipo salvaje (Figura complementaria 7A, Tabla complementaria 5). Dada la capacidad de señalización retenida en combinación con una mayor afinidad por el ligando de las variantes de PTH1R evolucionadas y el hecho de que la evolución dirigida se llevó a cabo en células de mamíferos que expresan proteínas G, especulamos que las mutaciones seleccionadas pueden haber optimizado el receptor para este contexto. De acuerdo con esta idea, en presencia de mini-G, la termoestabilidad aumentó para la mayoría de los mutantes (Fig. 7B complementaria), y para P34_05 la disminución disminuyó, dando una mejora relativa para todos los mutantes (Fig. 7C complementaria). Esto se hizo aún más evidente cuando comparamos la unión de diferentes ligandos en células completas. Como se muestra arriba, las afinidades de ambos agonistas, M-PTH(1–14) y PTH(1–34), aumentaron para las variantes de PTH1R en comparación con el PTH1R de tipo salvaje (Figs. 3d, 4a). Sin embargo, para el agonista parcial PTH(3–34), y más pronunciado para el agonista inverso IA-PTH(7–34), se observó una inversión en las afinidades relativas, donde el PTH1R de tipo salvaje tenía una afinidad aparente ligeramente mayor que el variantes evolucionadas (Fig. 4a). De acuerdo con el modelo de complejo ternario de señalización de GPCR, la asociación de proteínas G cambia el equilibrio conformacional del receptor hacia un estado activo, lo que aumenta alostéricamente la afinidad del agonista y, a su vez, disminuye la afinidad del antagonista41,42,43. Por lo tanto, especulamos que las variantes evolucionadas de PTH1R pueden haber incorporado mutaciones que estabilizan una conformación que favorece la unión a la proteína G, cambiando así el equilibrio del receptor hacia un estado de alta afinidad por los agonistas en presencia de proteínas G.

a Las variantes evolucionadas de PTH1R exhiben una unión de agonista de alta afinidad pero una afinidad igual o reducida por los agonistas parciales o inversos en las células. Curvas de unión de ligandos de competencia de [M-PTH(1–14) y PTH(1–34)], parcial [PTH(3–34)] y agonista inverso [IA-PTH(7–34)], medidas en conjunto células que expresan PTH1R de tipo salvaje o 5 variantes evolucionadas. b La alta afinidad por el agonista de las variantes de PTH1R evolucionadas es similar a la del PTH1R de tipo salvaje en el estado unido a la proteína G. Las curvas de unión de ligandos de M-PTH(1–14) a PTH1R evolucionados se midieron en fracciones de membrana, obtenidas de células que expresan PTH1R de tipo salvaje o 5 variantes evolucionadas, en ausencia (panel izquierdo) o presencia (panel central) de 12,5 µM mini-G. Constantes de unión relativas obtenidas por competición de la unión de M-PTH(1–14) con M-PTH(1–14) marcada, medidas en células enteras (de a) frente a fracciones de membrana en ausencia o presencia de mini-G 12,5 µM (panel derecho). Por lo tanto, los valores positivos reflejan una unión más fuerte en las fracciones de membrana que en las células. c El aumento de la afinidad del agonista depende de la proteína G. La unión de M-PTH(1-14) 40 nM se midió en fracciones de membrana complementadas con concentraciones crecientes de mini-G. Los datos son relativos a los niveles de unión de PTH1R en ausencia de mini-G (área gris). Panel izquierdo: variantes que muestran un aumento basal y dependiente de proteína G en la unión al ligando. Los valores de EC50 se indican como líneas verticales punteadas (PTH1R: 1,39 ± 0,2 µM, P34_05: 0,28 ± 0,06 µM, P34_13: 0,38 ± 0,1 µM). Panel derecho: variantes que muestran un aumento en la unión del ligando independiente de la proteína G. El aumento de la unión del ligando independiente de la proteína G se debe a una mayor actividad basal. Los niveles de cAMP se midieron 30 minutos después de la adición del inhibidor de fosfodiesterasa IBMX a las células que expresaban variantes de PTH1R y se normalizaron a los niveles de expresión del receptor. Los datos representan valores medios ± sem de 3 experimentos realizados por duplicado. **p = 0,0044, ****p < 0,0001. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional y comparación múltiple de Bonferroni. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para probar esta hipótesis, comparamos directamente el efecto de la proteína G en la unión del ligando. La afinidad de M-PTH(1–14) por PTH1R de tipo salvaje en fracciones de membrana aisladas aumentó 5 veces en comparación con su afinidad en células completas, lo que probablemente refleja la formación de un complejo de proteína G receptora más estable debido a concentraciones más bajas de nucleótidos en fracciones de membrana42. Por el contrario, las afinidades de los agonistas de las variantes desarrolladas permanecieron idénticas a sus afinidades en las células enteras. Solo para la variante P34_13, se observó una disminución en la afinidad al nivel de PTH1R de tipo salvaje al pasar de las células a las membranas. Al agregar mini-G a las fracciones de membrana, lo que imita el estado activado de la proteína G44, la afinidad de PTH1R de tipo salvaje se desplazó aún más hacia la de las variantes evolucionadas, lo que sugiere que, de hecho, el estado de alta afinidad de las variantes evolucionadas se debió a mayor propensión a adoptar una conformación de estado activo (Fig. 4b).

Para corroborar estos hallazgos, evaluamos además la influencia de la proteína G para inducir un estado de alta afinidad por cada una de las variantes. Para este propósito, se midió la ocupación del receptor por M-PTH (1-14) en concentraciones submáximas en función del aumento de las concentraciones de proteína G (Fig. 4c). Para todas las variantes de receptor evolucionadas ya en ausencia de proteína G añadida externamente, una fracción mayor del receptor se unió al ligando en comparación con el PTH1R de tipo salvaje, lo que refleja el estado de alta afinidad aparente observado en las curvas de unión competitiva. Como era de esperar, con el aumento de la concentración de proteína G, la unión fraccionada de M-PTH(1–14) a PTH1R de tipo salvaje se desplazó hasta 2 veces, lo que indica la transición del receptor a un estado de alta afinidad inducido por la proteína G vinculante. Las variantes P34_05 y P34_13 tuvieron un comportamiento similar, ya que ambas variantes cambiaron a un estado de alta afinidad al aumentar las concentraciones de proteína G añadida. Sin embargo, los valores de EC50 de 4 a 5 veces más bajos sugirieron que ambas variantes del receptor exhibieron una mayor afinidad por la proteína G, alcanzando así el estado de alta afinidad más fácilmente. Por el contrario, las variantes P34_06, P34_07 y P14_12 ya se encontraban en un estado de alta afinidad, que era independiente de la proteína G añadida. Del mismo modo, las últimas variantes exhibieron una mayor actividad del receptor basal, mientras que la actividad basal de las variantes P34_05 y P34_13 fue similar a la del PTH1R de tipo salvaje (Fig. 4d). Por lo tanto, la evolución de PTH1R con un agonista en un entorno competente en señalización ha llevado a la acumulación de mutaciones que favorecen la transición del receptor a un estado unido a proteína G activa o que promueven que la señalización del receptor basal esté en una conformación compatible con la unión del agonista. ambos dan como resultado una mayor afinidad aparente por los agonistas.

Los sistemas de selección de bacterias y levaduras se han utilizado para la evolución dirigida de los GPCR, ya que se pueden crear grandes bibliotecas, en las que cada célula porta una única variante de receptor. La alta eficacia de la transformación y el establecimiento de un número de copias de plásmido bastante uniforme aseguran que el enlace entre el genotipo y el fenotipo se conserva y ambos pueden determinarse fácilmente. Sin embargo, la aplicabilidad de los sistemas microbianos está limitada a ligandos relativamente pequeños que pueden usarse para la selección debido a la barrera externa de una pared celular o una membrana externa. Además, dado que se requiere una expresión mínima del receptor nativo al comienzo del proceso de selección, la toxicidad de algunos receptores puede ser un problema.

Aquí, demostramos el desarrollo de un sistema que no tiene tales limitaciones. Las células de mamífero ofrecen un entorno celular nativo para los GPCR, incluido el control de calidad durante la exportación, la composición de la membrana y la maquinaria de modificación postraduccional, lo que da como resultado condiciones de expresión óptimas incluso para receptores complejos. Al mismo tiempo, el bolsillo de unión del ligando es fácilmente accesible en la superficie celular para ligandos de cualquier tamaño y composición. Incluso los moduladores específicos de la conformación que se unen a la superficie extracelular, como los fragmentos de anticuerpos, podrían usarse como herramientas de selección. Además, en las células de mamíferos, los GPCR se integran en el marco de señalización celular endógeno. Esto ofrece la posibilidad de interrogar incluso las vías de señalización y, por lo tanto, dirigir la selección hacia propiedades de señalización específicas.

Sin embargo, la creación de bibliotecas clonales en células de mamífero es difícil. Los métodos de transfección estándar no son adecuados porque son relativamente ineficientes y, por lo general, cada célula absorbe varios cientos de plásmidos, con una propagación considerable de una célula a otra, lo que impide el acoplamiento de genotipo y fenotipo por cualquier medio. La clave de nuestro desarrollo fue aprovechar un sistema de transducción viral altamente eficiente que se basa en un vector Vaccinia24. Combina la posibilidad de ajustar la tasa de transducción a un promedio de una partícula por célula, manteniendo así la monoclonalidad, junto con una amplificación de vector inherente que alcanza números de copias bastante uniformes. Otra característica es un módulo de recombinación único en el vector viral que permite la creación de bibliotecas muy diversas que también son compatibles con proteínas grandes como los GPCR.

Si bien la mutagénesis aleatoria comúnmente se usa para generar diversidad genética, en su lugar hemos creado bibliotecas GPCR sintéticas mediante síntesis en fase sólida basada en codones45,46, lo que brinda un control total sobre la posición y la composición de la aleatorización, además de evitar los cambios de marco y los codones de parada. Por lo tanto, el conocimiento estructural y funcional previo puede incorporarse al diseño para mejorar los resultados de la selección, para excluir eventos de selección no deseados a priori e introducir un sesgo predefinido en la biblioteca, por ejemplo, para tipos de aminoácidos o un porcentaje de codones de tipo salvaje. Además, aquí usamos este enfoque para probar la fidelidad del sistema de selección al agregar a las bibliotecas mutaciones específicas con efectos predecibles. Para NTR1, la estructura cristalina10 sirvió como plantilla para identificar residuos adecuados para la aleatorización, y restringimos la mutagénesis a los aminoácidos correspondientes más comunes de todos los GPCR de clase A, manteniendo así un contexto evolutivo y excluyendo mutaciones potencialmente perjudiciales. Para PTH1R, diseñamos la biblioteca basada en un modelo de homología estructural y mutagénesis químicamente conservadora, ya que en ese momento no se disponía de información estructural ni de datos filogenéticos suficientes para PTH1R. Esto demuestra que incluso en ausencia de información estructural precisa, se pueden generar bibliotecas potentes. En el futuro, es posible que se deriven diseños de bibliotecas aún más sofisticados a partir de la cantidad cada vez mayor de información estructural y funcional en los GPCR que se pueden incorporar fácilmente al flujo de trabajo.

Nuestro primer objetivo fue recapitular las selecciones microbianas, es decir, la evolución del receptor en ausencia de efectores posteriores como las proteínas G, para comparar la fidelidad de este sistema de mamíferos con enfoques anteriores. Por lo tanto, la biblioteca de NTR1 se diseñó para contener la mutación R1673.50L, que interrumpe el motivo DRY en el núcleo del receptor, necesario para el acoplamiento de la proteína G14,27,28,29. En particular, aunque la mutación R1673.50L por sí sola no tuvo efecto sobre la estabilidad y solo un efecto modesto sobre los niveles de expresión en comparación con NTR1 de tipo salvaje, permitió el desacoplamiento del receptor de la proteína G, lo que condujo a la acumulación de mutaciones durante el selección que simultáneamente y fuertemente aumentó los niveles de expresión y la termoestabilidad (Fig. 5). Varias variantes incluso superaron los niveles de expresión de los receptores que habían experimentado una extensa evolución guiada por la expresión en E. coli26. Además, en línea con selecciones previas en sistemas microbianos, todas las variantes evolucionadas exhibieron una mayor afinidad por el agonista, a pesar de su incapacidad para activar las proteínas G. Es importante destacar que este hecho no impidió la selección de las características deseadas, mayor expresión funcional y estabilidad de la proteína. Como se observó en las estructuras de los receptores previamente estabilizados10,14, esto puede sugerir que el desacoplamiento de la ruta de transmisión de la señal tuvo dos consecuencias en el resultado de la selección: primero, se enriquecieron las mutaciones que endurecieron la parte extracelular del receptor de acuerdo con la unión del agonista, con la consecuencia de promoción de la unión de agonistas de alta afinidad, lo que nuevamente contribuye a la estabilidad del receptor. En segundo lugar, la parte intracelular del receptor se estabilizó mediante mutaciones que mantuvieron al receptor en una conformación inactiva, favorecida por la presencia de R1673.50L (fig. 5). En resumen, se puede considerar que las dos partes del receptor han evolucionado de forma independiente.

Los GPCR muestrean una multitud de estados conformacionales que están modulados alostéricamente por la unión de ligandos y proteínas G. La introducción de una mutación de desacoplamiento (estrella roja) conduce a la interrupción de la transmisión de la señal desde el bolsillo de unión del ligando a la interfaz de la proteína G (ruta izquierda). Así, en la evolución dirigida posterior en ausencia de proteína G o cuando su unión fue impedida por una mutación que ya estabilizaba el estado inactivo, se seleccionaron preferentemente mutaciones que estabilizaban aún más al receptor en un estado inactivo (gris), lo que condujo a un estado rígido y estable. conformación. Si la función del receptor se conserva al comienzo de la selección, el entorno celular, que contiene proteínas G, dicta el resultado de la selección. Se seleccionaron las mutaciones que promueven el acoplamiento alostérico entre la conformación ocupada por agonista del bolsillo de unión del ligando y la conformación de estado activo (AS) de la interfaz de unión de la proteína G (azul). En algunos casos, se enriquecieron las mutaciones que promueven un fuerte acoplamiento alostérico de la conformación del estado activo, lo que da como resultado una actividad receptora constitutiva (verde). Figura modificada según Nygaard et al.60.

Por el contrario, la biblioteca de PTH1R no contenía mutaciones fijas que se esperaría que interfirieran con la señalización aguas abajo. Como consecuencia, las proteínas G endógenas podían, en principio, interactuar con el receptor e influir en el resultado de la selección. De hecho, las mutaciones que se habían incluido deliberadamente en la biblioteca y que estabilizarían el receptor a costa de una capacidad de señalización reducida no se encontraron en estas condiciones de selección. De acuerdo con ese hallazgo, las variantes seleccionadas del receptor exhibieron una termoestabilidad aún más baja en comparación con el PTH1R de tipo salvaje en preparaciones de membrana desprovistas de proteínas G, lo que sugiere que se había seguido una vía de selección fundamentalmente diferente. La estabilidad aumentada esperada se observó tan pronto como se añadió la proteína G a las membranas.

Al igual que para NTR1, se observó un aumento general en la expresión del receptor y en la afinidad del ligando para la mayoría de las variantes, independientemente del agonista peptídico que se haya utilizado para la selección. La ganancia en la afinidad del ligando fue más pronunciada para M-PTH(1–14) que para PTH nativa(1–34). Teniendo en cuenta que las mutaciones estaban restringidas al TMD y que la M-PTH(1–14) no hace contactos adicionales con el ECD, era razonable suponer que los cambios dentro del TMD explicaban el aumento de la afinidad por el ligando. Las diferencias menos pronunciadas en la afinidad de la PTH(1–34) pueden explicarse por la energía adicional que proporcionan las interacciones de la parte C-terminal del péptido que se une con el ECD en los GPCR de clase B47.

Curiosamente, el aumento aparente de la afinidad del agonista por las variantes de PTH1R evolucionadas fue más prominente en las células completas. La unión del agonista a un GPCR cambia su equilibrio conformacional a un estado que favorece la interacción con las proteínas G48,49 y, por lo tanto, conduce a la activación de la proteína G mediante la desestabilización del bolsillo de unión de nucleótidos y la disociación del GDP50. El complejo ternario libre de nucleótidos resultante a menudo exhibe una mayor afinidad de unión al agonista41, pero tiene una vida extremadamente corta in vivo debido a las altas concentraciones intracelulares de GTP, lo que da como resultado una unión rápida de GTP a Gα51. En las fracciones de membrana, que carecen de nucleótidos en comparación con las células enteras, se observó un aumento relativo de la afinidad agonista del PTHR de tipo salvaje, lo que refleja la mayor estabilidad de los complejos ternarios en ausencia de nucleótidos. Esto fue aún más pronunciado al complementar las fracciones de membrana con mini-G, imitando el estado libre de nucleótidos de Gα. En estas condiciones, el receptor de tipo salvaje exhibió una afinidad agonista comparable a la de las variantes evolucionadas.

Por lo tanto, durante las selecciones de PTH1R, se adquirieron mutaciones que permiten que el receptor pase a un estado de alta afinidad incluso sin la ayuda de una conformación de proteína G en estado activo. Por lo tanto, el acoplamiento alostérico del sitio de unión del ligando con la conformación activa pero no inactiva del sitio de unión de la proteína G se ve potenciado por las mutaciones seleccionadas, lo que da como resultado simultáneamente una mayor afinidad por el agonista y la proteína G en muchos de los mutantes seleccionados31 (Fig. 5). ). De acuerdo con este hallazgo, la aparente afinidad por las mini-G aumentó en dos de las variantes evolucionadas. En particular, para tres variantes, no pudimos observar ninguna influencia adicional de las mini-G en la ocupación del receptor por parte del agonista. Curiosamente, esas tres variantes mostraron una mayor actividad del receptor constitutivo, lo que explica por qué el estado de alta afinidad del receptor no se altera más por la adición de proteína G.

En el presente estudio, utilizamos la unión de ligandos como sustituto de la expresión del receptor correctamente plegado e integrado y como presión de selección primaria. Si bien esto ha producido variantes de receptor optimizadas para expresión y estabilidad para NTR1, este no fue el caso para PTH1R cuando se midió como para NTR1. Se permitió que PTH1R evolucionara en un entorno de señalización completamente funcional, y observamos que la selección se vio fuertemente afectada por la función del receptor. Incluso sin aplicar una presión de selección directa sobre la unión a la proteína G, obtuvimos variantes de receptor que lograron una mayor estabilidad, pero solo cuando se les permitió participar en una proteína G. Sin embargo, a diferencia de las selecciones de NTR1, durante las selecciones de PTH1R, fue más difícil mantener el grupo de células con altos niveles de fluorescencia. No podemos excluir que bajo el estrés de la selección FACS con un vector viral de alto número de copias, se pierdan algunos clones de alta expresión, mientras que otros son compatibles. Además, las variantes que exhiben una alta actividad constitutiva pueden haberse perdido durante el curso de la selección debido a la constante internalización que hace que el receptor sea inaccesible para el ligando fluorescente y posiblemente también perjudique la viabilidad celular debido a la alta señalización basal.

En conjunto, este sistema de selección de mamíferos nos ha permitido seleccionar receptores que exhiben propiedades funcionales fuertemente alteradas que serán herramientas valiosas para estudiar los mecanismos de transmisión de señales en esta clase de receptores. Los receptores estabilizados pueden ser útiles en el descubrimiento de fármacos basado en fragmentos, donde las bajas potencias iniciales impiden los ensayos funcionales, y la búsqueda de aciertos tiene que depender de ensayos de unión, por ejemplo, por RMN y SPR16 en receptores solubilizados. Los mutantes con alta actividad constitutiva pueden ser candidatos especialmente interesantes para los enfoques de detección de drogas52. Como se señaló anteriormente, algunos de estos mutantes podrían pasarse por alto con la configuración actual; sin embargo, una salida podría ser utilizar otros parámetros de selección que miden directamente la señalización aguas abajo. En los últimos años, se ha puesto a disposición una multitud de sistemas de sensores para estudiar la función de GPCR en todos los niveles de la cascada de señalización en células de mamíferos. Muchos de estos ensayos se basan en la fluorescencia y, en principio, son compatibles con las aplicaciones de citometría de flujo. Dichos ensayos incluyen el receptor-proteína G, el receptor-arrestina o incluso los ensayos de interacción de la proteína G que se basan en sistemas de fluoróforo dividido o sensores FRET53,54,55,56,57. La integración de dichos sensores para la selección de receptores aumentará aún más la versatilidad de nuestro sistema de evolución de mamíferos, ya que la evolución de los receptores puede dirigirse hacia propiedades funcionales específicas. Esta estrategia debería resultar particularmente útil para descifrar los mecanismos de sesgo de señalización y los mecanismos reguladores de la transducción de señales mediada por GPCR. Además, permite la reutilización de receptores de membrana como biosensores para aplicaciones de detección de fármacos y podría usarse para crear herramientas para aplicaciones optogenéticas.

La PTH(1–34) y la PTH(3–34) humanas eran de Bachem. La neurotensina 8–13 [NT(8–13)] era de Anaspec. Peptide Specialty Laboratories sintetizó [Ac5c1, Aib3, Q10, Har11, A12, W14]PTH(1–14), [M-PTH(1–14)] humano. M-PTH(1–14) se marcó en K13 con colorante HiLyte 647 [M-PTH(1–14)-HL647]. [Nle8,18,Y34,C35]PTH(1–34) se marcó en C35 con colorante HiLyte 647 [PTH'(1–34)-HL647, la prima que indica los cambios de secuencia en comparación con PTH(1–34)]. La neurotensina 8–13 se marcó con fluorescencia con HiLyte-647 [HL647-NT(8–13)] o HiLyte-488 [HL488-NT(8–13)] en el grupo amino N-terminal. Todos los péptidos marcados con fluorescencia fueron sintetizados de forma personalizada por Anaspec.

Las células HEK293T (Cat. No. CRL-11268), A-431 (Cat. No. CRL-1555) y las células BS-C-1 (Cat. No. CCL-26) eran de ATCC y se cultivaron en medio modificado de Dulbecco. suplementado con suero fetal bovino al 10% (v/v). Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5 % de CO2, 95 % de aire. La transfección transitoria de células HEK293T se realizó con el reactivo TransIT-293 (Mirus) según el protocolo del fabricante. Las células CHO-S (Life Technologies, Cat. No. R80007) se mantuvieron como cultivo en suspensión con agitación usando medio Power CHO 2CD (Lonza) suplementado con L-glutamina 8 mM, hipoxantina 0,1 mM y timidina 0,1 mM. Las células se sembraron en DMEM con suero de ternero fetal al 10 % durante la noche para facilitar la adhesión antes de la transfección. La transfección transitoria se realizó con el reactivo Lipofectamine (Invitrogen) según el protocolo del fabricante.

MorphoSys AG sintetizó de forma personalizada bibliotecas de ADNc para NTR1 de rata y PTH1R humano como fragmentos de ADN lineal utilizando la tecnología Slonomics®26,45,46. Se amplificaron partes constantes de la secuencia a partir de un plásmido que contenía un tipo salvaje. Para generar las partes variables, se generaron mezclas de moléculas de anclaje en una proporción definida para representar todas las combinaciones de dos posiciones adyacentes dentro de una región variable26,45,46. Estas mezclas se conectaron a la cadena de ADN en crecimiento mediante ligación. El producto de reacción se purificó por inmovilización sobre una superficie recubierta de estreptavidina (Microcoat). A continuación, se generaron nuevos salientes para el siguiente ciclo de reacción mediante restricción con la enzima Eam1104I (Thermo Scientific) y se añadió una nueva mezcla de moléculas de anclaje. Después de tres a siete ciclos de reacción, los pares de productos se combinaron para generar productos intermedios de transposición. Estos se combinaron en una segunda ronda para formar regiones variables largas o se ensamblaron con partes constantes por restricción y ligadura. Las variantes de longitud se sintetizaron por separado, se cuantificaron mediante PAGE, se mezclaron en una proporción definida y se ensamblaron como un grupo. La biblioteca de PTH1R se sintetizó por separado en dos fragmentos de igual tamaño y se combinó mediante restricción con Esp3I (Thermo Scientific) en la región flanqueante y posterior ligadura. El producto de ligación final se amplificó a ~2 μg mediante PCR usando ADN polimerasa Phusion (NEB).

Se construyeron construcciones aceptoras para NTR1 de rata, que contenían un casete de clonación con la secuencia señal Mus musculus IgG aa 1–17, tanto para el plásmido de expresión de mamíferos (EFMOD, Vaccinex, sitios de clonación 5' BssHII y 3' SalI) como para el plásmido de transferencia de Vaccinia ( sitios de clonación VHEH5, Vaccinex, 5' BssHII y 3' BsiWI). El gen NTR1 de rata de tipo salvaje (aminoácidos 43–424), junto con las variantes de NTR1, L5X y TM86V, se amplificaron mediante PCR (ADN polimerasa de alta fidelidad iProof, BioRad) y los siguientes cebadores: NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3 ' y NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (para EFMOD) o NTRAddBsiW1stop-5'-tttttCGTACGtTCAGTACAGGGTCTC- 3' (para VHEH5) por protocolos estándar. Los productos de la PCR se clonaron posteriormente en los plásmidos de expresión y transferencia. La construcción de la biblioteca de ADN se realizó mediante PCR (Advantage2 polimerasa, Clontech) de la biblioteca mutante 2218_−1_LIB_rNTR1 (43-424) utilizando los mismos cebadores. El producto de PCR se resolvió en geles de agarosa al 1%/TBE. La banda de 1177 pb se purificó en gel (Qiaquick, Qiagen), se digirió y se ligó en el plásmido VHEH5 usando ADN ligasa NxGenT4 (Lucigen). La transformación de alta eficiencia se realizó mediante electroporación de células NEB10Beta E. coli (BioRad GenePulser, cubeta de 1 mm, 2,0 kV, 200 Ω, 25 µF) para crear una biblioteca de plásmidos con una diversidad de ~1,4 × 107.

Se construyeron construcciones aceptoras para PTH1R humano con un casete de clonación que contenía la secuencia señal de PTH1R aa 1–23 (incluido un sitio BsiWI de origen natural) y un sitio SalI 3' tanto para la expresión en mamíferos (EFMOD, Vaccinex) como para el plásmido de transferencia inducible de Vaccinia ( T7terVHE, Vaccinex). El gen PTH1R humano de tipo natural completo (1–593) se amplificó mediante PCR (Q5 ADN polimerasa, NEB) y se clonó en plásmidos de expresión y transferencia (BsiWI/Sall). La construcción de la biblioteca de ADN se realizó mediante PCR (Q5 DNA Polymerase, NEB) del ADN lineal de la biblioteca mutante SLN2248 con condiciones estándar y ciclos mínimos utilizando los siguientes cebadores: PTH1Rsignalsense 5-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' y PTH1R AS 5'-TGTCCGTTCGGTCGACTCACATGACTGTCTCC-3' . El producto de PCR se resolvió en geles de agarosa al 1%/TBE. La banda de 1734 pb se purificó en gel (Qiaquick, Qiagen), se digirió con BsiWI/Sall y se ligó en el plásmido T7TerVHE usando ADN ligasa NxGenT4 (Lucigen). La transformación de alta eficiencia se describió anteriormente para crear una biblioteca de plásmidos con una diversidad de ~6,3 × 106.

El virus vaccinia vector V7.5 (Vaccinex) se digirió con proteinasa K (Thermo Fisher) y el ADN se purificó mediante extracción con fenol/cloroformo. El ADN viral V7.5 se digirió con endonucleasas de restricción ApaI (NEB) y NotI (NEB) y se purificó con columnas ultracentrífugas Amicon (Millipore Sigma). Las células BSC-1 se infectaron con el virus auxiliar de la viruela aviar a una multiplicidad de infección (MOI) de 1,5 unidades formadoras de placas (pfu) por célula y se transfectaron con ADN del vector V7.5 digerido y cada biblioteca de receptores y los plásmidos de control correspondientes. Las células infectadas/transfectadas se incubaron durante 5 días y el virus Vaccinia se recogió congelando y descongelando las células. Se recogieron y amplificaron placas individuales para los clones de control. El ADN viral fue purificado y amplificado por PCR. Los clones positivos se confirmaron mediante secuenciación. La reserva de virus para la biblioteca se tituló mediante ensayo de placa. Los clones individuales se seleccionaron aleatoriamente y se comprobaron mediante PCR para determinar la eficacia de la recombinación. Las bibliotecas de Vaccinia resultantes tenían más del 95 % de eficiencia recombinante positiva y albergaban ~1,3 × 108 y ~1,1 × 108 recombinantes únicos para NTR1 y PTH1R, respectivamente.

Las células A-431 se sembraron el día antes de la infección en DMEM + FBS al 10 % (v/v) y se dejaron duplicar durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %. A continuación, las células se infectaron durante la noche a una MOI de 1 pfu por célula con controles de NTR1 que expresan virus o la biblioteca. La pfu apropiada de virus se diluyó en un volumen de medio mínimo para cubrir la monocapa celular y se incubó a 37 °C, 5 % de CO2 durante 1–2 h. Luego, las células se cubrieron con suficiente medio y se dejaron incubar durante 16 a 18 h. Las células se recolectaron usando Accutase™, se sedimentaron y se lavaron en tampón FACS [PBS, 1 % (p/v) de BSA] o tampón Tris [Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), NaCl 118 mM, glucosa 5,6 mM, KH2PO4 1,2 mM , MgSO4 1,2 mM, KCl 4,7 mM, CaCl 1,8 mM, BSA al 0,1 % (p/v)]. Las células se resuspendieron a razón de 2 × 106 células por ml en tampón FACS o tampón Tris y se incubaron con ligando fluorescente en hielo durante 1–2 h. Para confirmar la especificidad, también se incubaron muestras de células duplicadas con un exceso de 100 veces de ligando no marcado. A continuación, las células se lavaron en el tampón apropiado y se fijaron en paraformaldehído al 0,5 % con yoduro de propidio para la discriminación de células vivas/muertas antes del análisis en el citómetro de flujo. La estrategia de activación se ejemplifica en la Fig. 8 complementaria.

Las células A-431, infectadas con una biblioteca de clones NTR1, se clasificaron para múltiples iteraciones utilizando 40 nM NT(8–13)-HL647. Para la primera ronda de clasificación, se infectaron 4 × 107 células A-431 con la biblioteca NTR1 a una MOI de 1 durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2, como se describe anteriormente. Al día siguiente, las células se recogieron usando Accutase™ y se tiñeron con 40 nM del ligando en 1 ml de volumen total de tampón FACS en hielo durante una hora con agitación suave ocasional. A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron a razón de 2 × 107 células por ml y se pasaron a través de un filtro de 40 µm antes de clasificarlas en el clasificador BD FACS Aria. Se recogieron las células fluorescentes superiores al 0,3 % (6800 en total), se lisaron mediante múltiples ciclos de congelación/descongelación y se amplificó el virus en múltiples matraces de células BSC-1 durante 2 a 3 días.

El virus amplificado se recolectó y tituló antes de usarlo para infectar células A-431 nuevamente para una segunda ronda de clasificación. Dado que la diversidad del grupo del primer tipo era solo 6800, se infectaron 3 × 106 células A-431 para el segundo tipo. Los eventos del 0,06 % superior se recopilaron y amplificaron como se indicó anteriormente. El enriquecimiento en el tipo se probó mediante infecciones a pequeña escala y tinción de ligandos en todo momento.

Las células A-431 infectadas con una biblioteca de clones de PTH1R se clasificaron para iteraciones múltiples usando M-PTH(1-14)-HL647 120 nM o PTH'(1-34)-HL647 120 nM. Para la primera ronda de clasificación, se infectaron 1,2 × 108 células A-431 con la biblioteca inducible por PTH1R T7 y el virus promotor de T7 atenuado a una MOI de 1 durante la noche a 37 °C, 5 % de CO2, como se describió anteriormente. Al día siguiente, las células se recogieron usando Accutase™ y se tiñeron con 120 nM de ligando en un volumen total de 6 ml en hielo durante una hora con agitación suave ocasional. A continuación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS, se resuspendieron a razón de 2 × 106 células por ml y se pasaron a través de un filtro de 40 µm antes de clasificarlas en un clasificador BD FACS Aria. Se recogieron las células fluorescentes superiores al 0,5 %, se lisaron mediante múltiples ciclos de congelación/descongelación y se amplificó el virus en múltiples frascos de células BSC-1 durante 2 a 3 días.

El virus amplificado se recolectó y tituló antes de usarlo para infectar células A-431 nuevamente para una segunda ronda de clasificación. Cada ronda posterior de clasificación se realizó con 1,5 × 107 células A-431 y se incrementó la rigurosidad de selección para cada ronda. El enriquecimiento de clasificación se probó como infecciones a pequeña escala y tinción de ligando en todo momento.

El ADN de vaccinia se extrajo de los conjuntos clasificados (DNA Blood mini, Qiagen). Las variantes del grupo se amplificaron a partir del ADN del grupo mediante PCR (Advantage2 polimerasa, Clontech) mediante protocolos estándar con ciclos mínimos. Para NTR1, cebadores NTRBSSHIIsense 5'-tttttGCGCGCACTCCACCTCGGAATCCGACACGG-3' y NTRaddSal1 5'-ttttGTCGACTCAGTACAGGGTCTCCCGGGTG-3' (EFMOD), y para PTHR1, señal de sentido 5'-CTCAGCTCCGCGTACGCGCTGGTG-3' y PTHR1AS 5'-CCCCCCTCGAGGTCGACTCACATG ACTGTCTCCC-3'. Los productos de la PCR se clonaron posteriormente en el vector de expresión de mamíferos EFMOD. Se prepararon minibibliotecas seleccionando 92–94 colonias y aislando ADN plasmídico (Qiaprep 96 turbo, Qiagen). Las secuencias de ADN se analizaron mediante secuenciación de Sanger utilizando 2 o 3 cebadores para una cobertura completa.

Mini-Gs 393 se preparó esencialmente como se describe anteriormente44. Brevemente, las mini-G se expresaron en la cepa BL21 (DE3) de E. coli a 20 °C. Las células se recolectaron 16–20 h después de la inducción por centrifugación, se resuspendieron en tampón de lisis [HEPES 40 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, imidazol 5 mM, glicerol al 10 % (v/v), MgCl2 5 mM, GDP 50 μM , DTT 1 mM, 50 µg/ml de ADNseI, 50 µg/ml de lisozima] y se disgregó en un lisador de células HPL6 (Maximator GmbH) a 1700 bares. Los lisados ​​se aclararon por centrifugación (20 000 g durante 45 min) y los sobrenadantes se cargaron en columnas Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific). Las columnas se lavaron con tampón de lavado 10 CV [HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 500 mM, imidazol 28 mM, glicerol al 10 % (v/v), MgCl2 1 mM, GDP 50 μM, DTT 1 mM] y proteínas unidas se eluyeron paso a paso en 2 CV de tampón de elución [HEPES 20 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, imidazol 500 mM, glicerol al 10 % (v/v), MgCl2 1 mM, GDP 50 μM, DTT 0,5 mM]. El imidazol se eliminó en columnas de desalinización PD-10 (Cytiva), las proteínas se concentraron a 25 mg/ml y se congelaron instantáneamente en tampón de congelación [HEPES 25 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, glicerol al 15 % (v/v), MgCl2 5 mM, GDP 10 μM, DTT 0,25 mM].

Las variantes del receptor se transfectaron transitoriamente en células HEK293T. 48 horas después de la transfección, las células se separaron con Accutase™ y se incubaron con HL488-NT(8–13) 20 nM o PTH'(1–34)-HL647 100 nM en PBS suplementado con BSA al 0,2 % durante 2–4 h en hielo . La unión no específica se determinó en presencia de un exceso de 100 veces de péptido no marcado. A continuación, las células se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo y se determinaron las intensidades de fluorescencia en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences).

Los experimentos de unión de ligandos se realizaron en células completas o en membranas celulares obtenidas de células HEK293T transfectadas transitoriamente, usando en ambos casos un ensayo de unión a HTRF como se describe anteriormente11,14. Todas las variantes del receptor se subclonaron en un vector de expresión de mamífero que contenía una etiqueta SNAP N-terminal (Cisbio). Para las construcciones de NTR1, la etiqueta SNAP se fusionó con el residuo 43 del receptor. Para PTH1R, la etiqueta SNAP se fusionó con el residuo 29 o con el residuo 171, eliminando así el ECD. Las células HEK293T se transfectaron transitoriamente con construcciones de receptores y se sembraron a 20 000 células por pocillo en placas de 384 pocillos recubiertas con poli-L-lisina (Greiner) para ensayos de unión de células completas o a 5 × 106 células en placas de Petri de 10 cm para membrana preparación. 48 h después de la transfección, las células se incubaron con SNAP-Lumi4-Tb 50 nM (Cisbio) en tampón de unión al ligando [HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 3 mM y BSA al 0,02 % (p/v)] durante 2 h a 37 °C. Las células se lavaron cuatro veces con tampón de ensayo y se usaron directamente para experimentos de unión de ligandos de células completas, o se prepararon extractos de membrana celular crudos como se describió anteriormente. A continuación, se incubaron las células o 0,2–1 µg de membranas por pocillo durante 4 h en hielo para medir la unión del ligando, que contenían un péptido trazador marcado con fluorescencia junto con un intervalo de concentración de un péptido competidor no marcado. Para NTR1, se utilizaron 2 nM de HL488-NT(8–13) como péptido trazador. Para PTH1R se utilizaron 50 nM de M-PTH(1–14)-HL647 o 20 nM de PTH'(1–34)-HL647. Las intensidades de fluorescencia se midieron en un lector de placas de fluorescencia Spark (Tecan) con una longitud de onda de excitación de 340 nm y longitudes de onda de emisión de 620 nm, 520 nm y 665 nM para Tb3+, HiLyte Fluor 488 y HiLyte Fluor 647, respectivamente. Se calculó la proporción de las intensidades de fluorescencia del donante y del receptor de FRET. La unión total se obtuvo en ausencia de competidor y la unión no específica se determinó en presencia de un exceso de 100 veces de péptido no marcado. Los datos se normalizaron a la unión específica para cada experimento individual y se analizaron mediante ajuste global a una ecuación de competencia heteróloga de un sitio.

Los experimentos de señalización se realizaron en células completas con células HEK293T transfectadas transitoriamente como se describió antes11,14. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lavaron con PBS, se separaron con tampón de disociación celular (Gibco) y se lavaron nuevamente en PBS. Las células se resuspendieron en tampón de ensayo [Hepes 10 mM (pH 7,4), NaCl 146 mM, CaCl2 1 mM, MgCl2 0,5 mM, KCl 4,2 mM, glucosa 5,5 mM, LiCl 50 mM, 3-isobutil-1-metilxantina 1 mM). Los ensayos de acumulación de cAMP e IP1 se realizaron en placas blancas de 384 pocillos de bajo volumen (Greiner) utilizando el kit cAMP Tb y el kit IP-One Tb (ambos de CisBio), respectivamente, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la acumulación de AMPc, se incubaron 5000 células con agonista a las concentraciones indicadas durante 30 min a temperatura ambiente. Para determinar la señalización del receptor basal, las células se incubaron en tampón de ensayo que contenía isobutilmetilxantina (IBMX) durante 30 minutos en ausencia de ligando. Para la acumulación de IP1, se incubaron 20 000 células con agonista a las concentraciones indicadas durante 2 ha 37 °C. Las intensidades de fluorescencia se midieron en un lector de placas de fluorescencia Spark (Tecan). Para generar curvas de concentración-respuesta, los datos se ajustaron a una ecuación logística de tres parámetros.

La estabilidad de las variantes de receptor evolucionadas se midió en fracciones de membrana de células HEK293T transfectadas transitoriamente mediante la determinación del ligando unido al receptor residual después de un desafío térmico de las membranas. En el caso de PTH1R, el ECD (residuos 1–170) se eliminó de las construcciones de expresión para restringir las mediciones de estabilidad al TMD. Para NTR1, las células se dejaron sin modificar, mientras que para PTH1R, las células se marcaron con SNAP-Lumi-4Tb 50 nM antes de preparar las membranas como se describe anteriormente. Luego, las membranas se incubaron durante 2 a 4 h en hielo en un tampón de unión a ligando que contenía 20 nM de [3,11-tirosil-3,5-3H(N)]-neurotensina (Perkin Elmer) y 500 nM de M-PTH( 1–14)-HL647 para NTR1 y para PTH1R, respectivamente. Cuando se indique, se añadieron 25 µM de proteína mini-Gs a las fracciones de membrana antes de la adición del ligando. A continuación, se distribuyeron 0,5 µg de membranas por pocillo de una placa de 96 pocillos y se calentaron a una temperatura específica en un termociclador de PCR durante 20 min. A continuación, las membranas que contenían NTR1 se inmovilizaron en filtros de fibra de vidrio (Millipore), se lavaron cuatro veces con tampón de unión y se midió la actividad residual del radioligando en un contador de centelleo líquido MicroBeta Plus 1450 (Perkin Elmer). Para PTH1R, la unión del ligando residual se determinó mediante HTRF como se describe anteriormente. Los datos se analizaron mediante ajuste de regresión no lineal.

Los datos de citometría de flujo se analizaron en el software FlowJo V10 (BD Biosciences). La recolección y análisis de datos se realizó en Microsoft Excel V2108. Todos los demás análisis estadísticos y ajuste de curvas se realizaron en Prism V6.07 (GraphPad). Los detalles de cada análisis se describen en la sección de métodos experimentales, figuras, tablas y leyendas de figuras del experimento específico. Las alineaciones de secuencias y los diagramas de serpiente se obtuvieron de GPCRdb58. El análisis de secuencia se realizó con CLC Workbench V22.0.2. Las frecuencias de secuencia se visualizaron con WebLogo59. Las estructuras de proteínas se analizaron y visualizaron con PyMOL V2.8.2. La significación estadística de las diferencias se determinó mediante ANOVA unidireccional y multicomparación de Bonferroni.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos necesarios para evaluar las conclusiones del documento están presentes en el documento y/o en la Información complementaria. Entradas PDB disponibles públicamente utilizadas en este trabajo: 4BUO, 4L6R). Los datos de la secuencia del receptor utilizados en este documento están disponibles en GPCRdb. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Damos las gracias a Frank Murante y Kari Viggiani para la asistencia técnica de expertos. También nos gustaría agradecer a Pascal Egloff por sus valiosos aportes en el diseño de la biblioteca. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Academia Alemana de Ciencias Leopoldina (LPDS 2009-48) y una beca Marie Curie de la Comisión Europea (FP7-PEOPLE-2011-IEF #299208) a CK y por una subvención de Schweizerische Nationalfonds (31003A_182334) a punto de acceso

Departamento de Bioquímica, Universidad de Zúrich, Winterthurerstrasse 190, CH-8057, Zúrich, Suiza

Christoph Klenk, Anina Niederer y Andreas Pluckthun

Vaccinex, Inc., 1895 Mt. Hope Avenue, Rochester, Nueva York, 14620, NY, EE. UU.

Maria Scrivens, Shuying Shi, Loretta Mueller, Elaine Gersz, Maurice Zauderer y Ernest S. Smith

MorphoSys AG, Semmelweisstr. 7, 82152, Planegg, Alemania

Ralph Strohner

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investigación diseñada por CK, ESS, MZ y AP; CK, MS, AN, SS, LM y EG realizaron investigaciones; RS contribuyó con nuevos reactivos; datos analizados de CK, MS, AN, ESS, MZ y AP; CK y AP escribieron el artículo.

Correspondencia a Christoph Klenk o Andreas Plückthun.

MS, SS, LM, EG, MZ y ESS son empleados de Vaccinex, Inc. y poseen acciones u opciones sobre acciones en la empresa. RS es un empleado de MorphoSys AG y declara que no existen intereses en competencia. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Bryan Roth y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Klenk, C., Scrivens, M., Niederer, A. et al. Un sistema basado en Vaccinia para la evolución dirigida de GPCR en células de mamíferos. Nat Comun 14, 1770 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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Recibido: 10 noviembre 2022

Aceptado: 06 marzo 2023

Publicado: 30 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37191-8

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